禽呼腸孤病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的克隆表達(dá)及重組蛋白ELISA方法的建立.pdf

1、根據(jù)GenBank上的禽呼腸病毒(ARV)S1基因序列，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)跨越P10和P17非結(jié)構(gòu)蛋白基因的特異性引物，對(duì)13個(gè)ARV毒株進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、克隆及序列測(cè)定。結(jié)果顯示，13個(gè)ARV毒株的P10蛋白基因ORF全長(zhǎng)均為297bp，編碼98個(gè)氨基酸；P17蛋白基因ORF全長(zhǎng)為441bp，編碼146個(gè)氨基酸。這13個(gè)ARV毒株P(guān)10、P17蛋白基因核苷酸同源性分別在96.6％～100％和 98.2％～100％之間，推導(dǎo)的氨基酸同

2、源性分別在91.9％～09.0％和95.2％～99.3％之間。將這13個(gè)ARV毒株與GenBank上其他正呼腸病毒毒株，包括番鴨株(DRV)和飛狐上分離的內(nèi)爾森海灣病毒(NelsonBayvirus，NBV)及兩個(gè)澳洲分離株(ARM21和SOM24)進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果表明，呼腸病毒有地域和種類(lèi)的差別。 對(duì)ARV S1133株的P17非結(jié)構(gòu)蛋白基因完整ORF進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、與PGEX-4T-I原核表達(dá)載體連

3、接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.2mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析表明，表達(dá)的融合蛋白分子量為42.4kD，占全菌蛋白的34％。 Westem-blotting結(jié)果表明：原核表達(dá)的P17重組蛋白具有抗原性，能與活病毒感染的ARV陽(yáng)性血清反應(yīng)。 另外，誘導(dǎo)表達(dá)了ARV的兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白δ<,3>和δ<,2>以及兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白δ NS和P17，分別用不同濃度的尿素和Trit

4、on X-100對(duì)這四個(gè)蛋白進(jìn)行包涵體純化，各蛋白的終濃度分別為：38μg/mE、、48μg/mL、28μg/mE、 46μg/mL。經(jīng)BandScan4.3生物圖象分析軟件分析各蛋白的純度分別是： 68.6％、75.7％、84.0％和85.0％。達(dá)到較高的濃度和純度，說(shuō)明本試驗(yàn)探索的純化方法能有效的純化這些重組蛋白。最后，將純化的δ<,3>、δ<,2>和δ NS、P17蛋白分別作為包被用抗原進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，確定

5、其最佳包被濃度分別為9.5μg/mL、12.0μg/mL和9.3μg/mL、11.5μg/mL；一抗稀釋度均為1：200；HRP酶標(biāo)羊抗雞IgG稀釋度為1：5000，四種重組蛋白均不與NDV、AI和IBDV陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。本研究初步建立了能檢測(cè)ARV抗體的δ<,3>-ELISA、δ<,2>-ELISA方法，以及δ<,3>、δ<,2>兩個(gè)蛋白同時(shí)包被的δ<,3>-δ<,2>ELISA方法。用這三種方法對(duì)ARV活病毒

6、感染和滅活疫苗免疫雞的血清進(jìn)行檢測(cè)，表明δ<,3>-δ<,2>-ELISA方法在ARV抗體檢測(cè)方面具有較高的敏感性。用相同的方法建立了能鑒別ARV滅活疫苗免疫和活病毒感染的δ NS-ELISA和P17-ELISA方法，以及δ NS、P17兩個(gè)蛋白同時(shí)包被的δ NS-P17-ELISA方法，并對(duì)這三種方法進(jìn)行敏感性比較及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白同時(shí)包被的ELISA方法比單個(gè)抗原包被的方法能更好的區(qū)分ARV滅活疫苗免疫與活病毒感染