鹽霉素通過Notch-Hedgehog信號轉(zhuǎn)導通路對乳腺癌干細胞作用機制的研究.pdf

1、目的:乳腺癌在現(xiàn)如今世界上是女性最常見的惡性腫瘤，是引發(fā)女性死亡的主要原因。目前雖然在治療水平有了很大的提高，但仍不能使大多數(shù)患者受益。“腫瘤起源于腫瘤干細胞”這一學說的提出及對乳腺癌干細胞的深入研究為乳腺癌的治療提供了新的方向。腫瘤干細胞作為腫瘤組織的起始細胞，不僅具有自我更新和無限增殖的特征，還擁有重建腫瘤組織和放化療抵抗的能力，也是腫瘤放化療失敗和復發(fā)的重要原因所在。近些年來和乳腺癌干細胞相關的信號轉(zhuǎn)導通路的深入研究也為乳腺癌的臨

2、床治療提供了新的依據(jù)。
　　鹽霉素的分子結構是特殊的環(huán)狀結構，屬于一元羧酸聚醚類，是一種新型的離子載體型抗生素，起初在白色鏈霉菌中被發(fā)現(xiàn)。它能通過中和抵消細胞內(nèi)的大多數(shù)陽離子，對大部分的球蟲和各種革蘭氏陽性菌均有較強的殺滅作用，且不易產(chǎn)耐藥性和抗藥性，主要用于治療家禽球蟲病。而近些年，有研究人員提出鹽霉素具有抵抗腫瘤的作用特性，且在殺傷乳腺癌干細胞方面比普通化療藥物作用顯著。鹽霉素可通過Wnt/β-catenin、ER、MAPK以

3、及Akt/NF-kB這些信號轉(zhuǎn)導通路對多種腫瘤細胞發(fā)揮作用，并且這些信號轉(zhuǎn)導通路與乳腺癌干細胞也有著密切的聯(lián)系。而近期關于Notch、Hedgehog信號轉(zhuǎn)導通路的研究提示Notch、Hedgehog通路的異常激活與乳腺癌的產(chǎn)生有著重要的聯(lián)系。
　　本實驗主要為乳腺癌的治療提供依據(jù)，重點說明鹽霉素在殺傷乳腺癌干細胞的作用方面與Notch、Hedgehog通路的關系。
　　方法:培養(yǎng)人的乳腺癌細胞系MCF-7，并用不同濃度梯度

4、的鹽霉素處理后作用不同的時間。采用CCK-8檢測鹽霉素對MCF-7細胞生長的影響以及作用48小時后IC50時的鹽霉素的濃度;采用克隆形成實驗從克隆的形成能力方面觀察經(jīng)鹽霉素作用后乳腺癌細胞MCF-7增殖能力的變化;經(jīng)流式細胞術觀察鹽霉素作用48小時后細胞周期的改變;采用流式細胞儀在程序性細胞死亡方面檢測鹽霉素處理48小時后細胞早期的凋亡的水平的變化:Transwell和劃痕實驗是從侵襲和轉(zhuǎn)移的角度分析鹽霉素對乳腺癌細胞MCF-7的侵襲、

5、轉(zhuǎn)移能力的影響:進一步通過觀察乳腺球成球能力上直觀分析和流式細胞技術檢測CD44+CD24-（乳腺癌干細胞表面標記物）比例的變化;并且用RT-PCR和Western Blot進一步驗證乳腺癌干細胞另一重要標記物ALDH1的表達水平;RT-PCR和Western blot檢測經(jīng)鹽霉素處理后Notch/Hedgehog通路中靶基因Notch1、Hes1、SMO、Gli1的mRNA和蛋白表達的變化。
　　結果:1.CCK8檢測的結果顯示

6、:鹽霉素能抑制乳腺癌細胞的增殖，且具有時間-劑量依賴性，低濃度的鹽霉素(＜0.5umol/L)對乳腺癌細胞的抑制作用較弱，當濃度＞1umol/L時對細胞的抑制作用明顯增強，且48h的IC50為1umol/L?？寺⌒纬蓪嶒灥慕Y果表明:隨著鹽霉素濃度的增高細胞的克隆形成能力逐漸減弱。流式細胞儀檢測細胞周期水平變化時發(fā)現(xiàn):鹽霉素能將細胞周期阻滯在G0/G1期，而S期所占的細胞比例減少(0、0.5、1.0、1.5μmol/L的S期比例分別是45

7、.21％、33.23％、24.39％、11.85％)。采用流式細胞術檢測細胞凋亡水平可以觀察到:0、0.5、1.0、1.5umol/L的鹽霉素處理后細胞早期凋亡水平分別是1.5％，5.65％，17.71％，20.41％。2.流式細胞儀從干細胞表型標記的角度上檢測具有CD44+CD24-表型的細胞所占比例的結果顯示:經(jīng)0.5umol/L，1 umol/L，1.5umol/L鹽霉素處理后的比例分別是0.71％，0.32％，0.18％，顯著低

8、于對照組的1.2％。乳腺球成球試驗的結果發(fā)現(xiàn):隨著鹽霉素濃度逐漸增加，乳腺球的體積和數(shù)量也逐漸減小。RT-PCR和Western blot結果顯示:ALDH1的mRNA和蛋白水平隨著鹽霉素濃度的增加表達逐漸減少。
　　3.Transwell和劃痕實驗從侵襲轉(zhuǎn)移層面上檢測的結果發(fā)現(xiàn):隨著鹽霉素濃度的逐漸增加，乳腺癌細胞在侵襲和轉(zhuǎn)移方面的能力逐漸減小。
　　4.采用Western blot和RT-PCR檢測ALDH1以及Notc