共載鹽霉素鈉和多西他賽的PLGA納米粒靶向乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌干細(xì)胞的體內(nèi)外研究.pdf

1、乳腺癌是當(dāng)前威脅人類健康的高發(fā)癌癥，而中國是全球乳腺癌發(fā)病率最高的國家。乳腺癌目前的治療手段主要有手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療和免疫治療等，就當(dāng)前乳腺癌的治療情況而言，臨床使用的化療藥物（紫杉醇類，多柔比星以及順鉑類）雖然都是針對(duì)已經(jīng)分化的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行有效殺滅，但是存在體內(nèi)毒性較大，治療后易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。目前被廣泛認(rèn)可的復(fù)發(fā)原因主要是腫瘤組織中的乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，在經(jīng)過一段時(shí)間的休眠后，通過自我更新和分化形成新的腫瘤

2、，導(dǎo)致乳腺癌的復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移。
　　針對(duì)上述問題，我們提出三種方案:1、分別選取對(duì)乳腺癌細(xì)胞及干細(xì)胞具有顯著選擇性殺傷效果的藥物來殺傷乳腺癌細(xì)胞及干細(xì)胞，從而有效治療乳腺癌并防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移;2、利用抗腫瘤藥物的協(xié)同比例聯(lián)用來治療乳腺癌，增強(qiáng)對(duì)乳腺癌的治療效果;3、通過將藥物包載進(jìn)入納米載體中，制得的納米藥物具有靶向和降低毒性的特點(diǎn)。結(jié)合以上三種方案，本課題選用傳統(tǒng)的抗乳腺癌藥物多西他賽和新型抗乳腺癌干細(xì)胞藥物鹽霉素（鈉）聯(lián)用來治療乳

3、腺癌，兩種藥物分別選擇性作用于乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)協(xié)同殺傷，以期達(dá)到對(duì)乳腺癌增強(qiáng)治療的效果。
　　鹽霉素(Salinomycin)是一種環(huán)醚類的離子載體抗生素，可以選擇性作用于多種腫瘤干細(xì)胞，包括乳腺癌干細(xì)胞。另據(jù)報(bào)道，鹽霉素鈉(Salinomycin sodium)也具有相似效果，并具有更高性價(jià)比。多西他賽(Docetaxel)是目前臨床治療乳腺癌的一線化療藥物。而聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是已經(jīng)FDA批準(zhǔn)的一

4、種高分子藥用輔料，作為藥物載體具有生物相容性高，體內(nèi)安全無毒等特點(diǎn);D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作為一種出色的非離子表面活性劑，還具有抑制P-糖蛋白的外排作用，提高受P-糖蛋白阻滯的藥物的生物利用度，有效克服腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。據(jù)此，本課題利用PLGA-TPGS納米粒作為兩種藥物的載體，包載抗乳腺癌干細(xì)胞藥物鹽霉素鈉和抗乳腺癌藥物多西他賽，靶向遞送至乳腺腫瘤部位，在達(dá)到對(duì)乳腺癌產(chǎn)生有效治療的同時(shí)，也降低藥物對(duì)機(jī)體正常組織

5、的毒副作用。
　　本課題建立了SAL和DTX的HPLC體外含量測(cè)定方法學(xué)。SAL的線性方程為:A=1217.7C-3398(r2=0.9999)，線性范圍為:6.25～1000μg/mL.DTX的線性方程為:A=21836C+8557.8(r2=0.9999)，線性范圍為:1～100μg/mL.各項(xiàng)方法學(xué)參數(shù)均符合藥物的含量測(cè)定要求。為下一步載藥PLGA納米粒的包封率、載藥量測(cè)定及體外釋放度的考察奠定了HPLC方法學(xué)基礎(chǔ)。

6、　　選擇MCF-7乳腺癌細(xì)胞系為模型細(xì)胞，并利用無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)，從中篩選出MCF-7微球體（MCF-7-TS）作為乳腺癌干細(xì)胞模型。通過對(duì)乳腺癌干細(xì)胞表型標(biāo)記抗體CD44+CD24-的表達(dá)情況作為衡量指標(biāo)（乳腺癌干細(xì)胞鑒定金指標(biāo)），對(duì)作為乳腺癌干細(xì)胞模型的MCF-7-TS進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示，MCF-7-TS細(xì)胞中CD44+CD24-的表達(dá)率達(dá)60％以上，可以將其作為乳腺癌干細(xì)胞模型用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，SAL對(duì)MCF

7、-7-TS具有選擇特異性，而DTX對(duì)MCF-7-TS具有耐藥性，選擇性作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞;最后，在乳腺癌MCF-7細(xì)胞和MCF-7-TS細(xì)胞中篩選出DTX與SAL協(xié)同比例為摩爾比2∶1和1∶1.
　　采用納米沉淀法，成功制備出了空白PLGA納米粒、載鹽霉素鈉PLGA納米粒(NS)、載多西他賽PLGA納米粒(MD)及按協(xié)同比例共載鹽霉素鈉與多西他賽的PLGA納米粒(NSD)，并優(yōu)化了PLGA納米粒的處方，選取PLGA與TPG

8、S的最佳比例、SAL與DTX兩藥的最佳投藥比，作為PLGA納米粒的優(yōu)選處方。通過動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀(DSC)、透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)PLGA納米粒進(jìn)行了表征，結(jié)果表明，成功制備出了分布均勻、外形圓整、粒徑在70-100 nm左右、Zeta電位在-25 mV附近的PLGA納米粒。模擬在正常體內(nèi)和腫瘤組織中的pH釋放介質(zhì)條件下，分別對(duì)NSD中SAL和DTX的體外釋放情況進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示NSD中的兩藥在10d內(nèi)均具有一定程度的同步緩釋效

9、果。
　　以香豆素-6作為熒光探針，考察了乳腺癌MCF-7細(xì)胞和MCF-7-TS細(xì)胞對(duì)PLGA納米粒載體與游離C-6的攝取情況。結(jié)果顯示，乳腺癌MCF-7細(xì)胞和MCF-7-TS對(duì)載藥PLGA納米粒的攝取能力均高于對(duì)游離C-6的攝取能力。以DiR為熒光探針包載于NP中，通過荷瘤裸鼠活體成像，觀察納米粒在臟器與腫瘤中的分布情況，結(jié)果顯示，NP作為藥物載體，最主要聚集于腫瘤組織中，相對(duì)較少聚集于其他臟器中，因此表明NP具有高靶向乳腺腫瘤

10、組織的特性。通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，考察比較了空白PLGA納米粒、游離藥物單用及聯(lián)用、單載和共載兩藥的PLGA納米粒對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和MCF-7-TS細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，空白PLGA納米粒對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和MCF-7-TS細(xì)胞均無明顯細(xì)胞毒性;載藥PLGA納米?？杀３钟坞x藥物對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和MCF-7-TS細(xì)胞的毒性;NS+ND、NSD可保持SAL與DTX對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和MCF-7-TS細(xì)胞的細(xì)胞毒性，說明N

11、S+ND、NSD可同時(shí)作用于乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞且具有較強(qiáng)的殺傷作用。
　　采用HPLC-MS分別考察分析了SAL+DTX、NS+ND及NSD三組處方在雄性SD大鼠體內(nèi)的SAL和DTX的藥代動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果顯示，SAL緩釋效果最優(yōu)的為NS+ND組，DTX緩釋效果最優(yōu)的為NSD組，NSD組更好的保持了SAL與DTX的包載比例。
　　成功建立了MCF-7乳腺癌裸鼠模型，考察了Saline組、NP組、SAL組、DTX組、SAL

12、+DTX組、NS組、ND組、NS+ND組以及NSD組的體內(nèi)毒性及抗腫瘤活性。結(jié)果顯示，空白PLGA納米粒對(duì)裸鼠沒有明顯毒性;其中抗腫瘤活性最佳的為NSD組，且沒有明顯的系統(tǒng)毒性，抑瘤率為77.70±4.92.最后，通過對(duì)離體腫瘤組織進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)MCF-7-TS，考察了各處方的體內(nèi)抗乳腺癌干細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，NS+ND組與NSD組均可顯著的抑制MCF-7-TS的數(shù)量及體積，說明NS+ND組與NSD組對(duì)乳腺癌干細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用