基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)睡眠剝奪大鼠血清的初步研究.pdf

1、睡眠是人體最基本、不可或缺的生理活動(dòng)，是從事其它活動(dòng)的前提和基礎(chǔ)。無(wú)論是生理、還是心理上，人體都無(wú)法擺脫睡眠而長(zhǎng)期存在，睡眠質(zhì)量直接關(guān)系到人體的身心健康。當(dāng)代社會(huì)，由于高節(jié)奏、高速度和信息化發(fā)展模式帶來(lái)一系列生活方式的變化，加之各種主客觀原因如疾病、噪聲等，使得睡眠剝奪的發(fā)生成為常態(tài)，正日益成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。睡眠剝奪帶來(lái)神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等多方面的不良后果，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷尤為明顯，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力降低、注

2、意力下降及引起情緒和行為改變等。然而，睡眠剝奪引起機(jī)體損傷的確切原因和發(fā)生機(jī)理目前尚不清楚，深入研究睡眠剝奪相關(guān)分子并搜尋治療靶標(biāo)，對(duì)發(fā)現(xiàn)特異性治療方法和調(diào)控藥物均十分必要。
　　有多種建模方法用于睡眠剝奪研究，如水環(huán)境法、藥物刺激、輕柔刺激和強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)等，其中以水環(huán)境法最為經(jīng)典。由于水環(huán)境法模型動(dòng)物能觀察到動(dòng)物體重減輕、學(xué)習(xí)記憶能力下降和免疫力降低等現(xiàn)象，且異相睡眠時(shí)間減少、覺(jué)醒時(shí)間增加，而異相睡眠時(shí)間在恢復(fù)睡眠后顯著增加，覺(jué)醒時(shí)

3、間則顯著減少。因此，該方法系建立REM睡眠剝奪動(dòng)物的較理想方法。本課題采用改良多平臺(tái)水環(huán)境法(Modified multipleplatform method，MMPM)，選取大鼠，通過(guò)研究建立了24h快速眼動(dòng)睡眠剝奪（Rapid eye movement sleep deprivation，REM SD）模型。
　　血清蛋白譜的改變是許多疾病最直接的后果之一。血清蛋白質(zhì)組學(xué)(Serum proteomics)在研究疾病病理生理機(jī)

4、制、藥物作用靶點(diǎn)及早期診斷特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等方面具有重要作用。本課題即利用所建立的睡眠剝奪模型，研究其血清蛋白質(zhì)組學(xué)的變化情況。
　　血清蛋白組成復(fù)雜且比例懸殊，致使低豐度蛋白往往被高豐度蛋白掩蓋，導(dǎo)致其分辨率降低。因此，對(duì)血清樣本進(jìn)行處理并去除高豐度蛋白以提高低豐度蛋白的比例，是進(jìn)行相關(guān)研究最首要面對(duì)的難題。本研究首先系統(tǒng)考察了去除Wistar大鼠血清中高豐度蛋白的影響因素，優(yōu)化并改良了有機(jī)溶劑沉淀法。在上述工作的基礎(chǔ)上，最后

5、應(yīng)用血清比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)快速眼動(dòng)睡眠剝奪模型動(dòng)物的血清蛋白表達(dá)變化情況進(jìn)行了研究。
　　本實(shí)驗(yàn)總體步驟及結(jié)果為:(1)大鼠一般情況:睡眠剝奪組大鼠毛發(fā)光澤下降，精神稍差，較亢奮?？瞻讓?duì)照組和環(huán)境對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好、毛色整潔、光亮。24h睡眠剝奪對(duì)大鼠體重和學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)影響。(2) wistar大鼠血清蛋白組學(xué)研究方法的建立與優(yōu)化:調(diào)研分析有機(jī)溶劑沉淀法可能影響高豐度蛋白去除效果的關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)并考察不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)血清

6、高豐度蛋白去除的影響。建立最優(yōu)方法為以三氯乙酸∶丙酮為1∶9(v/v)，且混合液體積為處理血清體積的4倍時(shí)去除高豐度蛋白效果最佳;洗滌血清蛋白沉淀時(shí)，發(fā)現(xiàn)初始血清∶丙酮為1∶75(v/v)、洗滌3次時(shí)效果最佳。優(yōu)化等電聚焦過(guò)程中蛋白上樣量及等電聚焦電壓程序，建立最優(yōu)條件為上樣量1 mg/膠條，且等電聚焦程序設(shè)置為50 V條件下水化16h，250 V線(xiàn)性升壓0.5 h，1000V快速升壓1h，10000 V線(xiàn)性升壓5h，10000 V快速

7、升壓至70000Vh，1000 V快速降壓36 h。(3)差異蛋白分析:蛋白質(zhì)點(diǎn)主要分布在分子質(zhì)量20-95KDa、等電點(diǎn)4.5-6.5的區(qū)域內(nèi)?？瞻讓?duì)照組、環(huán)境對(duì)照組和睡眠剝奪組凝膠的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)、與主膠匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)計(jì)數(shù)、匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)占所在凝膠蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)的百分比和匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)占主膠中蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)百分比均無(wú)顯著差異。在分子量約10-30KDa、等電點(diǎn)5.5-6范圍內(nèi)，與環(huán)境對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，睡眠剝奪組至少有SSP號(hào)為5003

8、、5101共2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均表達(dá)下降。與空白對(duì)照組相比，點(diǎn)5003下降5.32倍，點(diǎn)5101下降4.41倍;與環(huán)境對(duì)照組相比點(diǎn)，點(diǎn)5003下降3.86倍，點(diǎn)5101下降4.99倍。在分子量約30-50KDa、等電點(diǎn)5.5-6范圍內(nèi)，與環(huán)境對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，睡眠剝奪組至少有SSP號(hào)為4310和4314共2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均表達(dá)下降，與空白對(duì)照組相比，點(diǎn)4310下降3.38倍，點(diǎn)4314下降5.21倍;與環(huán)境對(duì)照組相比點(diǎn)，點(diǎn)4310下降5.1

9、7倍，點(diǎn)4314下降4.82倍。在分子量約30-50KDa、等電點(diǎn)6-6.5范圍內(nèi)，與環(huán)境對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，睡眠剝奪組至少有SSP號(hào)為6206和7201共2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均表達(dá)下降，與空白對(duì)照組相比，點(diǎn)6206下降4.95倍，點(diǎn)7201下降3.41倍;與環(huán)境對(duì)照組相比點(diǎn)，點(diǎn)6206下降4.37倍，點(diǎn)7201下降3.53倍。在分子量約50-80KDa、等電點(diǎn)5.5-6范圍內(nèi)，與環(huán)境對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，睡眠剝奪組有至少有SSP號(hào)為36

10、06和2606共2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均表達(dá)上升，與空白對(duì)照組相比，點(diǎn)3606上升2.18倍，點(diǎn)2606上升4.74倍;與環(huán)境對(duì)照組相比點(diǎn)，點(diǎn)3606上升2.72，點(diǎn)2606上升2.69倍。(4)差異蛋白質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析:將上述6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)SSP4310、SSP4314、SSP5003、SSP5101、SSP6206、SSP7201進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜測(cè)定和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，對(duì)其歸屬進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)點(diǎn)SSP4310、SSP431

11、4、SSP5003、SSP5101、SSP6206、SSP7201分別為Serotransferrin、Serotransferrin、Glutathione peroxidase3、Ig kappa chain C region,B allele、Collagen alpha-2(Ⅰ) chain、Collagen alpha-2(Ⅰ) chain。Serotransferrin作為負(fù)性急性期反應(yīng)蛋白，其含量下降暗示機(jī)體抗氧化能力下降

12、而導(dǎo)致氧化損傷;Glutathione peroxidase3含量下降表明機(jī)體抗氧化能力可能下降，Ig kappa chain C region，B allele含量下降表明機(jī)體免疫力下降;Collagen alpha-2(Ⅰ) chain降低可能與SD引起心臟損傷有關(guān)聯(lián)。
　　通過(guò)上述研究，本課題建立并優(yōu)化了Wistar大鼠血清雙向電泳實(shí)驗(yàn)方法;通過(guò)對(duì)Wistar大鼠SD血清樣本的蛋白組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)24h睡眠剝奪后，8個(gè)蛋白發(fā)生