大鼠腎臟再灌注損傷模型肺內氧化應激狀態(tài)及PrxVI的表達變化.pdf

1、腎臟不僅能排泄體內代謝廢物，維持機體鈉、鉀、鈣等電解質穩(wěn)定及酸堿平衡，還具有內分泌功能。因此，腎臟對維持整個機體內環(huán)境的平衡至關重要。有研究表明:當腎臟功能受損時，其鄰近和遠端器官如心、肺、肝、腸和腦等的功能也會嚴重受損[1]。
　　腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是急性腎動脈阻斷或腎臟移植等臨床治療過程中常見的病理生理過程。它也是導致腎移植后功能恢復延遲或病人發(fā)生

2、急性腎衰的重要因素。當腎臟發(fā)生缺血再灌注時會產生大量的活性氧族(reac-tive oxygen species，ROS)，使腎臟處于高度氧化應激狀態(tài)，這也是缺血再灌注損傷的重要機制之一。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等。ROS化學性質非常活潑，可以破壞細胞內的蛋白質、DNA和脂類等生物大分子，從而影響細胞功能，甚至引起細胞和組織死亡。
　　Peroxiredoxin(Prx)是近幾年發(fā)現(xiàn)

3、的一類過氧化物酶系，PrxⅥ是其家族成員之一。PrxⅥ在哺乳動物肺部尤其是肺泡Ⅱ型上皮細胞表達非常豐富。研究表明:PrxⅥ具有谷胱甘肽過氧化物酶的生物活性，其功能主要是負責還原H2O2和磷脂過氧化物等。用高濃度氧、百草枯、H2O2等物質處理大鼠肺上皮細胞引起氧化應激反應后，PrxⅥ的mRNA和蛋白水平會明顯增強。當誘導PrxⅥ在肺上皮細胞系過表達時，能明顯增強細胞分解H2O2的能力，抑制細胞過氧化反應的發(fā)生。PrxⅥ基因敲除小鼠肺組織內

4、H2O2和MDA含量明顯高于對照組。以上這些說明PrxⅥ在肺組織內具有較強的抗氧化應激功能，在清除ROS防止肺組織過氧化損傷中可能發(fā)揮重要作用。肺臟是機體內對氧含量非常敏感的臟器之一。當RIRI發(fā)生時，肺臟是否也會處于氧化應激狀態(tài)，遭受過氧化損傷？PrxⅥ的表達水平如何改變？未見報道。
　　本研究通過采用無損傷動脈夾鉗夾腎動脈法建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型。24小時后觀察肺組織內MDA含量、H2O2含量，以及PrxⅥ基因水平和蛋白

5、水平的表達變化，探討腎臟缺血再灌注損傷時肺組織的過氧化損傷程度，以及PrxⅥ在缺血再灌注損傷過程中的抗氧化作用，為防治RIRI引起的肺組織損傷提供一條新思路。
　　目的:觀察大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型肺內的氧化應激狀態(tài)和抗氧化酶PrxⅥ基因和蛋白水平的表達變化，探討PrxⅥ在RIRI誘發(fā)的肺組織過氧化損傷中的作用。
　　方法:
　　1腎臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材
　　雄性Wistar大鼠12只，體重200±

6、10 g，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，隨機分為對照組(Control)和腎臟缺血再灌注損傷組(RIRI)，每組各6只。用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（5ml/kg），參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。RIRI組大鼠開腹后暴露其雙側腎臟，先切除右腎，然后鈍性分離左腎動脈，在靠近腎門處用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈，觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45 mins后松開動脈夾，恢復血液供應，肉眼可見腎動脈充盈，腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r

7、紅色，表明再灌注成功。對照組大鼠開腹后只切除右腎，分離左腎動脈，但不夾閉左腎動脈。24小時后收集血液，3000rpm離心10min，分離血清用于肌酐(Serum Creatinine，SCr)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN)濃度測定;處死大鼠取腎臟和肺臟，將腎臟于4％多聚甲醛中固定進行HE染色，觀察腎臟的形態(tài)學改變。將肺臟置于液氮中用于PrxⅥ mRNA和蛋白水平測定以及丙二醛(malondialdehyde

8、，MDA)和H2O2含量測定。
　　2測定指標及方法
　　2.1血清SCr和BUN水平測定
　　血清SCr濃度采用苦味酸法測定;血清BUN濃度采用酶偶聯(lián)速率法測定。
　　2.2 HE染色觀察大鼠腎臟的形態(tài)結構
　　腎臟組織經常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產Olympus光學顯微鏡下觀察腎臟的形態(tài)變化并進行圖象分析。
　　2.3大鼠肺組織MDA含量測定
　　將從-

9、70℃冰箱中取出的肺組織按照10mg/100μl加入預冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/LPMSF,0.1％Tween-20,0.5mol/LNaCl,1mmol/LEDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％肺組織勻漿，肺組織勻漿內MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。
　　2.4

10、大鼠肺組織H2O2含量測定
　　將從-70℃冰箱中取出的肺組織按照10mg/100μ l加入預冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/LPMSF,0.1％Tween-20,0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃C離心20min，取上清即制成10％肺組織勻漿。肺組織勻漿內H2O2含量采用鉬酸

11、比色法測定，以每克樣本蛋白所含的過氧化氫的量(mmol/g pro)表示。
　　2.5大鼠肺組織PrxⅥ mRNA水平測定
　　用TRIzol法提取肺內總RNA。約3μg總RNA反轉錄成cDNA。以GAPDH為內對照，進行RT-PCR。分別以PrxⅥ的擴增產物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對表達量
　　2.6大鼠肺組織PrxⅥ蛋白水平測定
　　采用Western blot法測定大鼠肺組織PrxⅥ蛋白水平。

12、將大鼠肺組織制成勻漿，離心后取上清。用改良Lowry法進行蛋白總量測定.電泳的蛋白上樣量為64 ug.經過轉膜和封閉處理后，在PVDF膜上加入兔抗PrxⅥ抗體，室溫靜置過夜。再加入熒光標記的抗兔IgG抗體.在雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進行圖像數值分析。
　　結果:
　　1大鼠腎組織的形態(tài)學改變
　　光學顯微鏡下可見正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲、遠曲小管及集合管形態(tài)結構清晰規(guī)整。而RIRI組大鼠可見腎血管球萎縮，體

13、積變小;腎小囊腔擴張;腎小管管腔明顯擴張，個別近曲小管上皮細胞水腫，胞漿疏松化;腎間質水腫，腎小管間隙擴大;集合管出現(xiàn)管腔擴張、上皮水腫等改變。
　　2血清SCr水平
　　Con組大鼠血清中SCr的濃度為103.444±8.465μmol/L，而RIRI組血清SCr的濃度為131.153±17.814μmol/L。RIRI組大鼠血清SCr濃度明顯高于Con組(P＜0.05)。
　　3血清BUN水平
　　Con組大

14、鼠血清BUN的濃度為4.462±0.541 mmol/L，而RIRI組血清BUN的濃度為13.685±4.397 mmol/L。RIRI組大鼠血清BUN的濃度明顯高于Con組(P＜0.05)。
　　4肺勻漿內MDA的含量
　　Con組大鼠肺勻漿內的MDA含量為7.63±1.68mmol/g，而RIRI組肺勻漿內的MDA含量為10.89±1.74 mmol/g。RIRI組大鼠肺勻漿內的MDA含量明顯高于Con組(P＜0.01)

15、。
　　5肺勻漿內H2O2的含量
　　Con組大鼠肺勻漿內的H2O2含量為16.51±2.39mmol/g，而RIRI組肺勻漿內的H2O2含量為21.85±4.16 mmol/g。RIRI組大鼠肺勻漿內的H2O2含量明顯高于Con組（P＜0.05）。
　　6肺組織PrxⅥ mRNA的相對表達量
　　采用RT-PCR的方法測定大鼠肺組織內PrxⅥ mRNA的相對表達量。Con組肺組織內PrxⅥ mRNA的相對表達量

16、為0.72±0.17，RIRI肺組織內PrxⅥ mRNA的相對表達量為1.09±0.23，RIRI組大鼠肺組織內PrxⅥmRNA水平明顯高于Con組(P＜0.01)。說明RIRI組大鼠肺組織內PrxⅥ的基因表達水平升高。
　　7大鼠肺組織PrxⅥ蛋白水平
　　Con組大鼠肺組織內PrxⅥ的蛋白表達水平為0.62±0.13，RIRI組大鼠肺組織內PrxⅥ的蛋白表達水平為0.88±0.16。RIRI組PrxⅥ蛋白水平明顯高于對照