萊菔硫烷對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷模型氧化應(yīng)激的影響.pdf

1、腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是臨床上一種常見(jiàn)的病理生理現(xiàn)象，多見(jiàn)于腎單位保留術(shù)、腎擠壓傷、腎動(dòng)脈阻斷術(shù)以及腎臟切除或移植等臨床治療過(guò)程中。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均發(fā)現(xiàn)：在暫時(shí)性阻斷腎臟的血液灌注，隨后又重新恢復(fù)其血液供應(yīng)的過(guò)程中，會(huì)有大量活性氧族(reac-tive oxygen species, ROS)產(chǎn)生,導(dǎo)致腎組織細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是引發(fā)缺血

2、再灌注損傷的主要機(jī)制之一。
　　核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor2,Nrf2)是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Nrf2通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element, ARE)相互作用調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達(dá)，是機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases, SOD)是機(jī)體內(nèi)

3、主要的ROS清除酶系，能通過(guò)歧化反應(yīng)將羥自由基(OH-)轉(zhuǎn)化成氧。同時(shí)，SOD也是 Nrf2轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因之一。萊菔硫烷(sulforaphane,SFN)在西蘭花等十字花科蔬菜中大量存在,屬于異硫氰酸鹽。大量研究表明：SFN是Nrf2通路的誘導(dǎo)劑，可通過(guò)上調(diào)Nrf2及其下游基因的表達(dá)發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤等生物學(xué)作用。
　　本研究采用無(wú)損傷動(dòng)脈夾鉗夾腎動(dòng)脈法建立大鼠RIRI模型，同時(shí)給予RIRI模型組大鼠Nrf2誘導(dǎo)劑萊菔硫烷

4、，觀察萊菔硫烷處理的大鼠RIRI模型腎組織形態(tài)學(xué)及功能變化、H2O2含量、MDA含量及抗氧化蛋白SOD活性及表達(dá)變化，探討萊菔硫烷在RIRI中發(fā)揮的抗氧化作用。
　　目的：通過(guò)觀察萊菔硫烷處理的大鼠RIRI模型腎組織形態(tài)學(xué)和功能變化、H2O2含量、MDA含量及抗氧化蛋白SOD活性及表達(dá)變化，探討萊菔硫烷是否可通過(guò)上調(diào)Nrf2下游基因SOD的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)ROS的清除作用，降低腎組織過(guò)氧化損傷程度，為萊菔硫烷對(duì)RIRI的防治研究提

5、供數(shù)據(jù)依據(jù)。
　　方法：
　　1動(dòng)物模型建立及檢測(cè)標(biāo)本的處理
　　Wistar大鼠來(lái)源于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雄性(體重200±10g)24只，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、腎臟缺血再灌注損傷模型組(RIRI組)、缺血+萊菔硫烷組(SFN1組)，灌注+萊菔硫烷組(SFN2組)。按照余曉東等人的模型制備方法建立RIRI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：腹腔注射6％水合氯醛(5ml/kg)麻醉大鼠。將RIRI組大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，酒

6、精消毒后開(kāi)腹充分暴露雙側(cè)腎臟,先將大鼠的右側(cè)腎臟切除后,再鈍性地分離其左側(cè)腎動(dòng)脈,并采用無(wú)創(chuàng)傷性動(dòng)脈夾在接近腎門(mén)部位夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈，阻斷腎臟血液供應(yīng),此時(shí)可以觀察到腎臟顏色由鮮紅色迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色。血液灌注阻斷45分鐘后棄去動(dòng)脈夾,重新恢復(fù)左側(cè)腎臟的血液灌注,此時(shí)可見(jiàn)左側(cè)腎動(dòng)脈迅速充盈,腎臟顏色也隨即由暗紅色轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅色,提示左側(cè)腎臟的血液重新灌注成功。Control組大鼠的消毒開(kāi)腹過(guò)程與RIRI模型組一致，但該組大鼠雙側(cè)腎臟暴露后只切

7、除其右側(cè)腎臟,鈍性地分離左側(cè)腎動(dòng)脈,但并不夾閉阻斷血液灌注。SFN1組大鼠在夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈后立即將二甲基亞砜稀釋的萊菔硫烷均勻涂抹于小腸表面，其余操作步驟同RIRI組。SFN2組大鼠在棄去血管夾恢復(fù)腎臟血液灌注后立即將二甲基亞砜稀釋的萊菔硫烷均勻涂抹于小腸表面，其余操作步驟同RIRI組。Control組和RIRI組只在小腸表面涂抹等量的二甲基亞砜?；謴?fù)大鼠腎臟血流灌注24小時(shí)后重新麻醉大鼠，收集右頸總動(dòng)脈血液，3000轉(zhuǎn)/分，離心10分

8、鐘,分離并收集血清，用于血清肌酐(Serum Creatinine，SCr)、血清尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN)含量檢測(cè);大鼠處死后切取其腎臟，取適宜大小的腎臟標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液中固定，用于HE染色法觀察大鼠腎臟組織的形態(tài)學(xué)改變。將其余腎臟組織迅速置于液氮中，待冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于大鼠腎組織SOD活性、基因表達(dá)水平測(cè)定，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和過(guò)氧化氫(h

9、ydrogen peroxide，H2O2)含量測(cè)定。
　　2檢測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法
　　2.1大鼠血清內(nèi)SCr和BUN含量檢測(cè)
　　采用苦味酸法檢測(cè)大鼠血清SCr含量；采用酶偶聯(lián)速率法測(cè)定大鼠血清BUN含量。SCr和BUN含量的測(cè)定過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。
　　2.2大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變的觀察
　　采用HE染色法觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。將4%多聚甲醛固定的腎臟標(biāo)本按梯度酒精脫水、二甲苯透明，石

10、蠟包埋處理后，將腎臟標(biāo)本切片厚度約5μm，然后進(jìn)行蘇木精伊紅染色處理，采用奧林帕斯光學(xué)顯微鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變并拍照。
　　2.3大鼠腎組織MDA含量檢測(cè)
　　腎組織MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定，檢測(cè)過(guò)程按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。
　　2.4大鼠腎組織H2O2含量檢測(cè)
　　腎組織H2O2含量采用鉬酸比色法測(cè)定，檢測(cè)過(guò)程按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。
　　2.5大鼠腎組織SOD活性檢測(cè)
　　腎組織SOD活

11、性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，檢測(cè)過(guò)程按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行
　　2.6大鼠腎組織SOD基因表達(dá)水平檢測(cè)
　　采用RNA提取試劑盒裂解提取大鼠腎組織內(nèi)的總RNA。RNA定量后將2μg RNA反轉(zhuǎn)錄成模板 cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參照，進(jìn)行Real-Time PCR相對(duì)定量分析。
　　結(jié)果：
　　1大鼠腎組織的

12、HE觀察結(jié)果
　　HE法觀察大鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。光鏡下可見(jiàn)：Control組大鼠腎近曲小管、遠(yuǎn)曲小管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整。腎小球形態(tài)規(guī)則、腎小囊大小正常。RIRI組大鼠：腎小球明顯萎縮體積變小，腎小囊間隙顯著增寬，近曲小管、遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞萎縮，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)空泡，管腔擴(kuò)張明顯。SFN2組大鼠：腎小球略有萎縮體積變小嗜伊紅染色增強(qiáng)，腎小囊有所顯擴(kuò)張，近曲小管細(xì)胞略顯腫脹，小管之間間隙變窄，遠(yuǎn)曲小管管腔增寬。SFN1組大鼠：腎小球嗜伊紅染色

13、有所增強(qiáng)，腎小囊間隙略顯增寬，近曲小管略有腫脹，小管之間間隙變窄，遠(yuǎn)曲小管管腔略增寬程度輕于SFN2組。
　　2血清內(nèi)SCr含量的改變
　　與Control組大鼠血清內(nèi)SCr的含量(59.87±6.76μmol/L)相比， RIRI組(358.08±22.20μmol/L)、 SFN2組(294.14±18.76μmol/L)、 SFN1組(93.60±13.16μmol/L)大鼠血清SCr含量均明顯升高(P<0.05)，但

14、SFN2組和SFN1組大鼠血清SCr含量低于RIRI組(P<0.05)，SFN1組大鼠血清SCr含量又低于SFN2組(P<0.05)。
　　3血清內(nèi)BUN含量的改變
　　與Control組大鼠血清內(nèi)BUN的含量(6.35±1.15 mmol/L)相比，RIRI組(24.80±2.53 mmol/L)、SFN2組(20.01±1.78 mmol/L)、SFN1組(12.32±1.69 mmol/L)大鼠血清BUN含量均明顯升高

15、(P<0.05)，但SFN2組和SFN1組大鼠血清BUN含量低于RIRI組(P<0.05)，SFN1組大鼠血清BUN含量又低于SFN2組(P<0.05)。
　　4腎組織MDA含量的改變
　　與Control組大鼠腎組織MDA含量(72.29±14.75 mmol/g)相比，RIRI組(284.32±17.48 mmol/g)、SFN2組(186.52±17.50 mmol/g)、SFN1組(161.31±14.03 mmol

16、/g)大鼠腎組織MDA含量均明顯升高(P<0.05)，但SFN2組和SFN1組大鼠腎組織MDA含量明顯低于RIRI組(P<0.05)，SFN1組大鼠腎組織MDA含量又低于SFN2組(P<0.05)。
　　5腎組織H2O2含量的改變
　　與Control組大鼠腎組織H2O2含量(85.70±10.66 mmol/g)相比，RIRI組(260.62±48.50 mmol/g)、SFN2組(160.84±23.34 mmol/g)

17、、SFN1組(121.22±18.49 mmol/g)大鼠腎組織H2O2含量均明顯升高(P<0.05)，但SFN2組和SFN1組大鼠腎組織H2O2含量明顯低于RIRI組(P<0.05)，SFN1組大鼠腎組織H2O2含量又低于SFN2組(P<0.05)。
　　6大鼠腎組織SOD活性改變
　　與Control組大鼠腎組織SOD活性(112.47±9.09 U/mg pro)相比，RIRI組(28.56±6.11 U/mg pro

18、)、SFN2組(43.85±5.29 U/mg pro)、SFN1組(65.44±8.91 U/mg pro)大鼠腎組織SOD活性均明顯降低(P<0.05)，但SFN2組和SFN1組大鼠腎組織SOD活性高于RIRI組(P<0.05)，SFN1組大鼠腎組織SOD活性又高于SFN2組(P<0.05)。
　　7腎組織SOD基因的表達(dá)改變
　　Real-Time PCR法測(cè)定大鼠腎組織SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)水平， GAPDH作為擴(kuò)

19、增內(nèi)對(duì)照。與Control組大鼠腎組織SOD mRNA表達(dá)量(0.93±0.13)相比， RIRI組(1.15±0.15)、SFN2組(1.36±0.18)、SFN1組(1.39±0.18)大鼠腎組織SOD mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)。SFN2組和SFN1組大鼠腎組織SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)水平又高于RIRI組(P<0.05)，但SFN2組和SFN1組SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P﹥0.05)。此結(jié)果表明：在RI