FTY-720調(diào)節(jié)去勢大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化Smad信號通路的機制研究.pdf

1、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者因為本身雌激素水平的下降，導(dǎo)致全身骨骼系統(tǒng)代謝平衡紊亂，直至骨質(zhì)疏松，因此絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥實質(zhì)上是一種骨代謝異常引起的代謝類疾病。我國中老年婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率據(jù)不完全統(tǒng)計已達(dá)到50％，其根本原因是破骨細(xì)胞的骨吸收作用和成骨細(xì)胞的骨形成作用嚴(yán)重失衡，導(dǎo)致骨量減少和骨顯微結(jié)構(gòu)退化變性，使得骨質(zhì)脆弱，骨折發(fā)生率高。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥也是造成頜面部骨質(zhì)損失的主要危險因素，此種情況一旦發(fā)生，不僅可導(dǎo)致牙槽骨的吸收，還可

2、發(fā)生更為嚴(yán)重的牙齦萎縮、牙根暴露、基牙附著喪失、基牙脫落甚至頜骨萎縮等一系列不利于臨床正畸治療的棘手問題，給患者帶來了痛苦和生活質(zhì)量的下降，同時也給正畸科臨床醫(yī)生的治療帶來巨大的障礙。當(dāng)前臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要采取激素替代療法，或用鈣和其他藥物制劑來抑制骨吸收。由于藥物制劑本身有副作用，再加上吸收不良，療效不穩(wěn)定，患者依從性差等一系列不可控因素，這些方法不能取得令人滿意的治療效果。
　　來源于動物骨髓中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（

3、boanae mararowa daeraivaeda mesaencahyamala steama cealalsa,BaMMaSaCas），具有成體干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能，能分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨的生長、形成以及骨的修復(fù)過程。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的同時，來源于患者體內(nèi)的BMMSCs其成骨分化能力在基因水平衍生出了明顯的缺陷，有研究表明引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨質(zhì)流失的一個重要因素就是其體內(nèi)BMMSCs的成骨分化減弱，而成脂

4、分化增強。目前還沒有找到確鑿可靠的方法從基因水平改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者BMMSCs成骨分化能力減弱的狀況。
　　FTY-720（fingolimod，芬戈莫德）是1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）的化學(xué)類似物。最初由日本學(xué)者從中草藥冬蟲夏草的有效成分多球殼菌素ISP-1改造而成，作為一種新型的免疫制劑廣泛應(yīng)用于臨床。近來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY-720有促進(jìn)成骨樣細(xì)胞系向成骨分化的能力。然而，F(xiàn)TY

5、-720能否改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者BMMSCs受損的成骨能力至今未見報道，且FTY-720促進(jìn)成骨的相關(guān)機制也未見有相關(guān)研究。
　　Smad信號通路是成骨分化過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用的信號通路之一。Smads蛋白家族充斥在這個通路各個環(huán)節(jié)中，而其中的Smad4蛋白處于Smad信號通路中游水平，它在分類上屬于通用型轉(zhuǎn)運蛋白，可以與Smads蛋白家族中的受體型Smad1、2、3、5、8耦合輔助其轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控下游基因的表達(dá)，可見其

6、作用之重要。因此，本課題的目的旨在首先驗證FTY-720能否從基因水平改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型的BMMSCs的成骨分化缺陷，然后通過針對Smad4基因設(shè)計siRNA序列構(gòu)建慢病毒載體，感染骨質(zhì)疏松動物模型的BMMSCs形成shRNA（Sahaorat haaiarapina RaNaA,短發(fā)夾樣RaNaA）穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，抑制細(xì)胞內(nèi)Smad信號通路中Smad4蛋白的表達(dá)從而阻斷Smad信號通路，再次驗證FTY-720能否在基因水平改善絕經(jīng)

7、后骨質(zhì)疏松動物模型的BMMSCs的成骨分化能力。初步探尋FTY-720促成骨作用的相關(guān)機制。為達(dá)此目的，本課題設(shè)計了以下研究內(nèi)容。
　　研究內(nèi)容：
　　1）建立去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型
　　SD大鼠首先分為兩組：去勢組（OVX）和假手術(shù)組（SHAM）。OVX組直接用外科手術(shù)方法將雌性SD大鼠雙側(cè)卵巢行卵巢切除術(shù)（ovariectomy，OVX），此組即是用來建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的動物模型組；另一SHAM組則在相同條件下只切

8、除卵巢周圍等量的脂肪組織。大約90天過后，分別對兩組大鼠進(jìn)行稱重，并用Micro-CT掃描儀對骨密度（BMD）、骨小梁厚度指數(shù)（tarabaecualara tahaickanaesas,Tab.Tah）和骨小梁體積分?jǐn)?shù)（baonae voaluamae fraactaioan,BaVF）進(jìn)行測量，以鑒定大鼠骨質(zhì)疏松動物模型是否建立成功。
　　2）不同濃度梯度FTY-720對OVX大鼠BMMSCs成骨分化的影響
　　動物模型

9、一旦確認(rèn)構(gòu)建成功，則利用全骨髓貼壁法結(jié)合酶消化時間控制的方法來分離純化rBMaMaSCas（rat BMaMSaCsa,大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）。用倒置顯微鏡來觀察細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)來檢測細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá)，使用MaTaT法對細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測，利用成骨、成脂誘導(dǎo)實驗檢測細(xì)胞的多向分化能力。
　　配制1nM、10nM、100nM三個濃度梯度的FTY-720成骨誘導(dǎo)液，對分別來自O(shè)VX組與SHAM組的rBMMSCs連續(xù)

10、誘導(dǎo)21天，在7、14、21天時檢測細(xì)胞成骨相關(guān)基因（Runx2、Sp7、OCN、ALP）mRNA的表達(dá)水平，在21天時檢測這些基因的蛋白表達(dá)水平，從而判斷細(xì)胞的成骨分化狀況。
　　3）慢病毒介導(dǎo)的Smad4基因沉默對FTY-720增強rBMMSCs成骨能力的影響
　　根據(jù)在基因庫里查詢到的大鼠Smad4的基因信息，使用Invitrogen在線siRNA序列設(shè)計軟件，設(shè)計合成3條針對目的基因CDS區(qū)的siRNA序列以及一條無

11、意義的亂序排列的siRNA-Negative序列作為對照組應(yīng)用于實驗中。然后依照每條siRaNaA序列的堿基編碼，設(shè)計出互補的兩條DaNaA模板單鏈，再按照反應(yīng)體系合成出相應(yīng)的DNaA單鏈。DaNaA單鏈退火完成后，與shaRaNA質(zhì)粒的表達(dá)載體（GaV11a2a Vecator）進(jìn)行連接反應(yīng)后送至基因公司進(jìn)行基因測序。
　　將測序結(jié)果與設(shè)計相一致的shRNA1、shRNA2、shRNA3制備已經(jīng)編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒載體p

12、GV-LV，重組病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功后，即對質(zhì)粒的DNA進(jìn)行去內(nèi)毒素抽提；使用HEK-293T細(xì)胞接受shRNA病毒表達(dá)載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，而后對病毒轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行觀察。釆用qRT-PCR和Westernblot的方法檢測293T細(xì)胞的Smad4基因被干擾后，其內(nèi)源性Smad4基因的mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平以驗證干擾是否成功。再根據(jù)結(jié)果用干擾效率最高的shRNA2病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株繼續(xù)下一步研究。在293T細(xì)胞內(nèi)包裝和生產(chǎn)慢病毒顆粒的步驟完成后

13、，測定病毒滴度。按照梯度稀釋法以重組慢病毒顆粒過夜感染去勢組大鼠BMMSCs，篩選能夠達(dá)到有效感染效率（80%以上）的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。qRT-PCR和WesternBlot分別檢測去勢大鼠BMMSCs穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株內(nèi)Smad4基因干擾和蛋白抑制的效率。
　　然后繼續(xù)用qRT-PCR和Westernblot的方法檢測10nMFTY-720誘導(dǎo)下去勢大鼠BMMSCs穩(wěn)轉(zhuǎn)株成骨相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)情況，以評價Smad4基因靶向抑制對FTY-72

14、0促rBMMSCs-OVX成骨作用的影響。
　　4）慢病毒介導(dǎo)的Smad4基因沉默對去勢大鼠顱骨缺損模型在FTY-720促成骨作用下愈合質(zhì)量的影響
　　首先用手術(shù)方法構(gòu)建去勢大鼠顱骨直徑為7mm圓形缺損模型，用明膠海綿分別復(fù)合穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（shRNA2慢病毒表達(dá)載體感染去勢大鼠BMMSCs穩(wěn)定沉默Smad4的轉(zhuǎn)染細(xì)胞）和正常的去勢大鼠BMMSCs（對照）充填于骨缺損處，5周后行Micro-CT掃描檢測顱骨缺損處骨形成情況，以評

15、價FTY-720對去勢大鼠的骨修復(fù)作用，以及靶向抑制了Smad4基因后此作用的消失。
　　研究結(jié)果
　?、傩g(shù)后3個月，兩組間大鼠體重、骨密度、骨小梁厚度指數(shù)及骨小梁體積分?jǐn)?shù)均具有統(tǒng)計學(xué)差異。去勢組大鼠體重增加，股骨、脛骨骨密度、骨小梁厚度指數(shù)及骨小梁體積分?jǐn)?shù)都降低。②體外采用全骨髓自然貼壁篩選法結(jié)合酶消化時間控制方法分離培養(yǎng)的rBMMSCs其形態(tài)大部分為長梭形或者多角形，可以長滿整個培養(yǎng)皿底，MTT曲線是典型的“S”形，且從

16、第4天開始OVX組BMMSCs的OD值高于SHAM組。細(xì)胞表面標(biāo)志物為間充質(zhì)標(biāo)記物CD29，CD44，CD90和血管細(xì)胞黏附分子CD106呈現(xiàn)強陽性；造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34和CD45呈陰性。并具有向成骨、成脂方向分化的能力，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是rBMMSCs。
　?、蹣?gòu)建了1nM,10nM,100nM三個濃度的FTY-720成骨誘導(dǎo)液分別對rBMMSCs-OVX（去勢組大鼠的BMMSCs）和rBMMSCs-SHAM（假手術(shù)組大鼠的

17、BMMSCs）進(jìn)行了成骨誘導(dǎo)，這三組培養(yǎng)液均能使細(xì)胞的成骨相關(guān)基因（Runx2、Sp7、OCN、ALP）mRNA的表達(dá)和蛋白表達(dá)增高，其中以10nM組的最高，促進(jìn)成骨能力最強。
　　④對作為表達(dá)載體的質(zhì)粒GV112進(jìn)行酶切線性化處理后與設(shè)計的3條siRNA成功進(jìn)行了連接及轉(zhuǎn)化，制備出用于感染的4種shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體（包括用于對照的Negative組）。⑤對基因重組后的4種慢病毒質(zhì)粒載體成功進(jìn)行了慢病毒的包裝、感染和純化，qRT

18、-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示shRNA2的慢病毒表達(dá)載體干擾效率最高，所以選用以shRNA2序列為基礎(chǔ)的慢病毒顆粒構(gòu)建rBMMSCs-OVX的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
　?、蕹晒?gòu)建了rBMMSCs-OVX+Lenti-shRNA2（LV-S2-OVX）的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。qRT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示LV-S2-OVX穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的Smad4基因mRNA水平與蛋白水平均被明顯抑制。
　　⑦與對照組無意義序

19、列shRNA病毒感染細(xì)胞株相比（rBMMSCs-OVX+shRNA-Negative），10nM的FTY-720誘導(dǎo)液條件下LV-S2-OVX穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的成骨相關(guān)基因（Runx2、Sp7、OCN、ALP）mRNA和蛋白的表達(dá)水平被明顯抑制。
　　⑧Micro-CT掃描結(jié)果顯示無意義鏈病毒感染細(xì)胞株LV-Neg-OVX復(fù)合明膠海綿修復(fù)骨缺損，術(shù)區(qū)有較明顯新骨形成。而穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（LV-S2-OVX）組的術(shù)區(qū)無新骨形成，骨缺損清晰可見。

20、
　　研究結(jié)論:
　　1）采用以全骨髓貼壁篩選法為基礎(chǔ)，結(jié)合酶消化時間的控制來分離培養(yǎng)rBMMSCs-OVX與rBMMSCs-SHAM這兩組細(xì)胞，其純化和擴增效果良好；再根據(jù)其生物學(xué)特性，以流式細(xì)胞術(shù)檢測的表型特征為參考，便能對rBMMSCs進(jìn)行鑒定。而OVX手術(shù)本身不會改變rBMMSCs的表型特征。
　　2）1nM,10nM,100nM三個濃度的FTY-720都可以促進(jìn)rBMMSCs-OVX的體外成骨分化能力，其中以

21、10nM的FTY-720促成骨分化能力最強。
　　3）構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（rBMMSCs-OVX+Lenti-shRNA2,LV-S2-OVX）對大鼠BMMSCs的Smad4基因的干擾效率高，穩(wěn)定性好。
　　4）抑制了Smad信號通路核心因子Smad4基因后，F(xiàn)TY-720的促成骨分化作用明顯降低，說明FTY-720的促成骨分化作用是通過Smad信號通路實現(xiàn)的。
　　5）體內(nèi)實驗證實，抑制了Smad4基因，F(xiàn)TY-720