Shh蛋白對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長作用及其相關機制研究.pdf

1、目前，腦血管病已成為人類死亡的首要疾病，并且具有患病率高、致殘率高、死亡率高、復發(fā)率高的特點，其中腦梗死約占腦血管病的85％，因此研究和防治腦梗死具有極其重要的社會意義。據(jù)報道對腦梗死的的治療效果不盡如人意，腦梗死后神經(jīng)功能的損傷是患者致殘的主要原因。神經(jīng)元突起損傷是導致神經(jīng)功能障礙的重要原因。如何促進神經(jīng)元突起的生長是腦梗死后期治療的關鍵。
　　腦梗死導致腦組織受到不同程度的損傷，神經(jīng)網(wǎng)絡結構被破壞，從而導致神經(jīng)功能受損。而神經(jīng)

2、可塑性又可以促使形成新的豐富神經(jīng)網(wǎng)路結構并能修復病變，從而改善缺血腦組織的神經(jīng)功能。因此研究給予藥物等加強神經(jīng)修復的作用顯得尤為重要。由于神經(jīng)元突起對于神經(jīng)網(wǎng)絡結構的修復具有重要意義，因此，尋找能夠有效促進神經(jīng)元突起生長的藥物，是當前面臨的重要并且熱點課題。
　　Sonic hedgehog(Shh)是分泌性糖蛋白因子，在胚胎和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育和分化中可調(diào)控神經(jīng)細胞的增殖、分化和軸突的形成。國內(nèi)外研究報道大鼠腦缺血中，Shh可通

3、過調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的增殖、分化和突起的形成發(fā)生來促進神經(jīng)元可塑性，并且參與調(diào)控腦組織室下區(qū)神經(jīng)再生。然而，到目前為止，查閱大量文獻后發(fā)現(xiàn)Shh蛋白對大腦皮層神經(jīng)元細胞神經(jīng)突起的作用及其機制仍未明確，仍需深入研究，這對增強神經(jīng)環(huán)路的研究具有重要意義。
　　氧化應激是腦梗死的重要病理生理機制，應用氧化應激模型有助于理解腦梗死的發(fā)病機理并開展相關治療。因此本課題利用皮層神經(jīng)元的氧化應激模型來模擬腦梗死后皮層神經(jīng)元的損傷，研究Shh蛋白對氧化

4、應激下皮層神經(jīng)元細胞的保護作用。
　　線粒體是能量產(chǎn)生的主要場所，可在控制神經(jīng)重構包括神經(jīng)分化、神經(jīng)突生長、神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及樹突重構等的基本過程中發(fā)揮著重要的作用。線粒體功能失調(diào)可能在腦梗死后神經(jīng)重塑中具有重要作用。調(diào)節(jié)腦梗死后線粒體的形態(tài)和功能可以介導神經(jīng)突起的生長，而神經(jīng)突起的生長是一個能量消耗的過程，需要足夠的能量供應，因此，能量的代謝和線粒體與神經(jīng)突起的生長高度相關。研究報道激活經(jīng)典的Shh調(diào)節(jié)的信號通路可以增加線粒體活性

5、。但是關于Shh對于氧化應激后皮層神經(jīng)元線粒體的影響報道較少，仍需深入研究。
　　綜上所述，本研究首先利用孕15-18天C57BL/6胎鼠確立小鼠皮層神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng)模型，其次利用此模型觀察Shh蛋白對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長的促進作用，并探討其可能的影響機制，最后利用皮層神經(jīng)元的氧化應激模型來模擬腦梗死，觀察Shh對皮層神經(jīng)元的活性和神經(jīng)突起的作用，并從線粒體和能量代謝的角度探討Shh對氧化應激下皮層神經(jīng)元及其突起發(fā)揮保護作

6、用的機制。本研究分為三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。
　　第一部分小鼠皮層神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng)及細胞鑒定
　　目的：通過對孕15-18天內(nèi)C57BL/6胎鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，掌握小鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)方法，并觀察細胞的形態(tài)學；利用免疫細胞化學鑒定所培養(yǎng)的細胞是否為神經(jīng)元細胞，以備后續(xù)實驗。
　　方法：C57BL/6雌雄小鼠交配獲取孕15-18天胎鼠，麻醉后斷頭取腦，于預冷1×HBSS溶液的平皿中，在解剖顯微鏡下取

7、出完整的大腦及小腦，夾除小腦，將大腦半球放入盛有預冷的1×HBSS溶液的平皿中，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，分離出皮層組織。將其剪碎放入15ml塑料離心管離心管內(nèi)加入3ml Papain消化液（新鮮配制），37°C孵育箱內(nèi)孵育15~30分鐘棄去Papain消化液，加入3ml Hibernate E洗滌，反復直至變成細胞懸液，200 rpm離心3分鐘，棄去上清，加入含2%B27的Neurobasal培養(yǎng)液，制成單細胞懸液，種植于 Poly-L

8、-lysine處理過的培養(yǎng)皿中，于濕潤的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5% CO2），并于不同時間點于顯微鏡下觀察所培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元細胞的生長情況并記錄。取培養(yǎng)1天皮層神經(jīng)元，4%多聚甲醛固定，0.3% triton-X100破膜打孔作用15分鐘，10%驢血清室溫封閉45分鐘，加入抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase，NSE)和兔抗鼠的膠質(zhì)細胞中間絲蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary

9、acidic protein, GFAP）一抗4℃過夜，然后加入驢抗小鼠FITC(1:200)，驢抗兔TRITC(1:200)，37℃，1 h，熒光封片劑后于熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元并鑒定神經(jīng)元細胞。
　　結果
　　1皮層神經(jīng)元細胞剛接種時的細胞為圓形，2小時后開始貼壁，培養(yǎng)至6~8小時后，少數(shù)神經(jīng)元細胞可見有明顯的細胞突起的生成。培養(yǎng)第24小時后，神經(jīng)元細胞胞體清晰、豐滿，胞體呈現(xiàn)錐體或星形，光暈的輪廓較明顯，細胞突起增長。

10、培養(yǎng)第2天，細胞胞體增大，更清晰，突起明顯變長，而且突起之間形成了一定的聯(lián)系。培養(yǎng)第3天，絕大多數(shù)神經(jīng)元細胞的突起已經(jīng)相互連接，并形成網(wǎng)絡結構。
　　2本實驗應用免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn) NSE標記的神經(jīng)元細胞在視野中出現(xiàn)較多，并顯示出完整的神經(jīng)元形態(tài)，而且細胞胞體豐滿，突起生長較多；視野中未發(fā)現(xiàn)GFAP標記的膠質(zhì)細胞。
　　結論
　　1本實驗利用無血清培養(yǎng)法成功建立了小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng)模型，具有穩(wěn)定性高、純度

11、高和存活率高的皮層神經(jīng)元細胞，是一種研究神經(jīng)科學的理想模型。
　　2本試驗利用免疫熒光法對所培養(yǎng)神經(jīng)元細胞的鑒定結果提示對胎鼠腦皮層細胞進行原代培養(yǎng)獲得的神經(jīng)元細胞存活率高，純度高，為后續(xù)實驗打下了良好的基礎。
　　第二部分Shh蛋白對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的作用及與BDNF機制研究
　　目的：觀察Shh蛋白對小鼠皮層神經(jīng)元細胞神經(jīng)突起的生長作用，并探討Shh蛋白對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的作用及其相關的可能機制。
　　方

12、法：取孕15-18天的C57BL/6小鼠的原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元進行實驗，分為對照組、不同濃度的Shh（5,50,500ng/ml）組、Shh信號通路抑制劑環(huán)耙明（cyclopamine, CPM）組、CPM+Shh組和酪氨酸激酶抑制劑K252a+Shh組。抑制劑在加入Shh蛋白前30min提前加入，藥物作用于神經(jīng)元細胞24小時后進行后續(xù)實驗。利用免疫熒光法檢測神經(jīng)元細胞中Shh受體（Ptch）的表達；β-Tubulin免疫熒光細胞化學染

13、色法測定 Shh對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長長度；RT-qPCR法檢測神經(jīng)元細胞中 Shh和Ptch基因水平表達；RT-qPCR和Western-bloting法檢測神經(jīng)元細胞中BDNF基因和蛋白水平表達；免疫熒光細胞化學染色法測定神經(jīng)元神經(jīng)突BDNF的含量；按照BDNF試劑盒說明書采用ELISA法測定神經(jīng)元培養(yǎng)液中BDNF的含量。
　　結果
　　1首先證實Shh受體—Ptch在皮層神經(jīng)元細胞存在，提示Shh蛋白可能對調(diào)節(jié)皮層

14、神經(jīng)元神經(jīng)突的生長具有生物學效應。
　　250 ng/ml和500 ng/ml的Shh蛋白組能夠明顯促進神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長（P<0.05）。特別有趣的是，50ng/ml的Shh蛋白組對神經(jīng)突起的生長的促進作用更加明顯，因此，后續(xù)實驗選用Shh濃度為50ng/ml進行。
　　3與單用Shh蛋白組相比， Shh和CPM共同作用后能夠顯著降低神經(jīng)突起的長度（P<0.05），提示Shh介導的神經(jīng)突起的生長作用部分能被CPM阻斷。<

15、br>　　4 Shh蛋白干預均能夠誘導細胞中Shh和Ptch的基因表達增加，給予CPM后，Shh誘導細胞中Shh和Ptch基因表達增加均部分被抑制(P<0.05)。
　　5 Shh蛋白干預能夠使神經(jīng)元細胞BDNF在mRNA和蛋白水平上增加，給予CPM后，Shh介導的BDNF的表達增加被抑制(P<0.05)。
　　6 Shh蛋白干預能夠使神經(jīng)元細胞的神經(jīng)突起中BDNF表達增加，與CPM聯(lián)用后，這種增加部分被抑制。
　　7

16、 Shh蛋白干預能夠使細胞培養(yǎng)液中BDNF的含量也增加，給予CPM后，細胞培養(yǎng)液中BDNF的含量增加也被抑制(P<0.05)。
　　8與單用Shh組相比，K252a和Shh聯(lián)合作用組對皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長長度有所降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：本試驗結果顯示小鼠皮層神經(jīng)元細胞中存在 Shh受體-Ptch，并且Shh蛋白能夠促進皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長，Shh蛋白可能部分通過激活Shh信號通路實現(xiàn)其對

17、腦皮層神經(jīng)元的神經(jīng)突起的促生長作用；此外Shh蛋白還可能通過促進BDNF的表達來發(fā)揮其對神經(jīng)突起的促生長作用，最終實現(xiàn)Shh蛋白的神經(jīng)保護作用。
　　第三部分 Shh蛋白對氧化應激下皮層神經(jīng)元活性和神經(jīng)突起的作用及其線粒體機制研究
　　目的：觀察Shh蛋白對氧化應激下小鼠皮層神經(jīng)元細胞的活性影響和神經(jīng)突起的生長作用的影響，觀察Shh蛋白對氧化應激下皮層神經(jīng)元細胞中活性氧（Reactive Oxygen Species, RO

18、S）、超氧化物岐化酶（Superoxide Dismutase，SOD）及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的影響，并檢測Shh蛋白對氧化應激下線粒體形態(tài)和功能的影響以及對能量代謝和線粒體氧化呼吸鏈復合物酶II的影響，進而探討Shh蛋白對氧化應激下皮層神經(jīng)元的活性和神經(jīng)突起的作用及其可能的線粒體和能量代謝機制。
　　方法：取孕15-18天C57BL/6小鼠的胎鼠，取其皮層組織，進行細胞原代培養(yǎng)。皮層神經(jīng)元培養(yǎng)24小時

19、后，加入100 uM H2O2處理2h，然后換液繼續(xù)以神經(jīng)元培養(yǎng)液培養(yǎng)，體外模擬腦缺血模型。實驗分為對照組、H2O2組、H2O2+Shh組進行后續(xù)實驗。利用CCK-8法檢測Shh蛋白對氧化應激下皮層神經(jīng)元的細胞活性的影響；利用β-Tubilin免疫熒光細胞化學染色法測定 Shh蛋白對氧化應激下皮層神經(jīng)元神經(jīng)突的長度的作用；Western-bloting檢測各組皮層神經(jīng)元細胞中GAP-43蛋白水平表達和免疫熒光細胞化學染色法測定各組中皮層

20、神經(jīng)元細胞GAP-43的表達；利用用活性氧檢測試劑盒測定各組神經(jīng)元細胞內(nèi)的ROS的表達變化，結果為所檢測得的熒光值與對照組的熒光度的比值（%of control）表示；根據(jù)SOD和MDA說明書的說明步驟測定Shh蛋白對各組細胞中SOD活性和MDA的含量表達變化；通過透射電鏡觀察各組中皮層神經(jīng)元線粒體形態(tài)的改變；利用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)檢測各組神經(jīng)元細胞線粒體膜電位（MMP）的變化情況。利用ATP活性試劑盒檢測各組皮層神經(jīng)元

21、ATP活性的變化情況；利用線粒體呼吸鏈復合物酶 II試劑盒分析各組神經(jīng)元細胞線粒體呼吸鏈復合物酶II活性。
　　結果
　　1 CCK-8法檢測結果H2O2能夠降低神經(jīng)元細胞的活性，當加入Shh蛋白后，細胞活性的能力增強，50，500 ng/ml的Shh能顯著促進氧化應激的神經(jīng)元細胞存活率。
　　2與對照組相比，神經(jīng)元受到H2O2作用后，其神經(jīng)突起的生長損傷（P<0.05），而在H2O2作用后加用Shh蛋白后神經(jīng)元神經(jīng)突

22、的生長得到一定程度的恢復（P<0.05），結果具有統(tǒng)計學差異。應用免疫熒光和Western blot法檢測細胞中 GAP-43的實驗結果顯示 H2O2作用于神經(jīng)元細胞后GAP-43的表達降低，而加入Shh蛋白后其表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），進一步證實Shh蛋白能改善氧化應激損傷的皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長。
　　3與對照組相比，H2O2作用于皮層神經(jīng)元后，其細胞內(nèi)ROS含量升高，SOD活性下降，MDA含量升高，而給

23、予Shh蛋白干預后，神經(jīng)元細胞內(nèi)ROS含量下降，SOD活性上升，MDA含量下降（P<0.05）。
　　4透射電鏡顯示，與對照組相比，H2O2作用后神經(jīng)元內(nèi)的線粒體損傷嚴重，線粒體腫脹，空泡化，并且結構也破損。當加入Shh蛋白干預后，線粒體形態(tài)得到一定程度的恢復，空泡化和腫脹的線粒體減少。MMP結果顯示，與對照組相比，H2O2作用于皮層神經(jīng)元后，神經(jīng)元細胞的MMP下降，而給予Shh蛋白干預后，神經(jīng)元細胞的MMP較之上升（P<0.05

24、）。
　　5 ATP檢測結果顯示，H2O2組細胞的ATP的量與對照組相比明顯下降，Shh蛋白干預后，神經(jīng)元細胞的 ATP量有所好轉(zhuǎn)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　6 H2O2作用于神經(jīng)元后線粒體呼吸鏈復合物酶II的活性下降，而在氧化應激后給予Shh蛋白治療后，其活性較H2O2組好轉(zhuǎn)（P<0.05）。
　　結論：本試驗利用氧化應激模型模擬腦缺血狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)Shh蛋白能促進氧化應激的皮層神經(jīng)元的存活和神經(jīng)突起