重組腺病毒介導的CXCR7基因沉默增強肝癌SMMC-7721細胞對TRAIL敏感性的實驗研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌指起源于肝細胞或肝內(nèi)膽管細胞的癌癥，是惡性程度極高的腫瘤之一。其發(fā)病率目前在全球逐漸上升。據(jù)報道:全世界每年有近62萬人被確診為原發(fā)性肝癌，由肝癌所致死亡病例每年約60萬，其發(fā)病率和致死率分別位居全球惡性腫瘤排名的第六位和第二位。而我國是肝癌發(fā)病率最高的國家之一，每年約有55％新發(fā)肝癌病例發(fā)生在中國。手術治療、化療和放療仍是目前治療肝癌的主要手段，但隨著腫瘤分子生物學的發(fā)展及對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的不斷深入研究，

2、生物治療已成為手術、化療和放療治療腫瘤的重要輔助治療手段，或者在某種程度上已成為第四種治療腫瘤的重要手段，被喻為腫瘤的“綠色療法”。腫瘤生物治療是通過運用一種或多種生物學技術來提高腫瘤患者機體自身的免疫力對腫瘤細胞進行殺傷，防止腫瘤復發(fā)和轉移，而對正常機體影響降至最低的一種治療新方法。目前，生物治療腫瘤的技術主要包括三種:腫瘤基因治療、腫瘤的生物細胞免疫治療及腫瘤干細胞的靶向治療。其中，轉錄后水平的基因沉默技術自1998年Fire等首次

3、報導以來，引起了醫(yī)學界廣泛的關注，并將其視為具有開創(chuàng)性意義的攻克癌癥基因治療的突破點。
　　腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是新近發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員之一。它可以選擇性地對腫瘤細胞誘導凋亡，而對機體正常組織細胞不產(chǎn)生凋亡誘導和毒性作用。隨著對TRAIL的研究不斷深入，目前TRAIL誘導細胞調(diào)亡的機制已經(jīng)闡明，典型表現(xiàn)是依賴于Caspase的激活

4、和級聯(lián)反應。即通過TRAIL與死亡受體結合后募集Caspase8前體形成死亡受體復合物(death-inducing signaling complex，DISC)，從而激活Caspase8前體形成裂解產(chǎn)物來激活下游Caspase3前體產(chǎn)生級聯(lián)效應誘導腫瘤細胞凋亡。但部分腫瘤細胞卻對TRAIL誘導的凋亡具有天然或獲得性耐受性，這在很大程度上限制了TRAIL在臨床腫瘤治療中的廣泛應用。大量研究表明，在體外幾乎所有的肝細胞肝癌細胞系均對TR

5、AIL表現(xiàn)不同程度的耐受性，某些基因的過表達是導致凋亡信號終止的重要因素。因此，尋找并降低某基因的表達可能是克服肝癌細胞對TRAIL耐受的重要方法。
　　CXCR7作為最近研究發(fā)現(xiàn)一種新的趨化因子受體，對腫瘤的影響是多方面的。有研究報道CXCR7可以通過Akt信號通路的激活來阻礙腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而使腫瘤細胞的存活能力得以增強。而活化后的Akt通路可以增加腫瘤細胞對TRAIL的耐受性。陳等研究證實在肝癌細胞中活化的Akt信號通路

6、可以使肝癌細胞對TRAIL產(chǎn)生耐受性。那么，下調(diào)CXCR7的表達是否能增強肝癌細胞對TRAIL的敏感性呢？因此本課題以我國自行研究的肝癌SMMC-7721細胞作為研究對象，構建并篩選出沉默效率最高的一組shRNA-CXCR7腺病毒表達載體，通過體外和體內(nèi)實驗研究下調(diào)CXCR7的表達聯(lián)合TRAIL是否能對肝癌SMMC-7721細胞及裸鼠移植瘤的生物學行為產(chǎn)生影響。
　　方法：
　　一、實驗材料
　　細胞株和實驗動物:人肝

7、癌SMMC-7721細胞株購自中國科學院上海研究所細胞庫。6周齡體重18-20克BALB/c裸鼠20只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
　　二、主要研究方法
　　1、通過RNA干擾技術構建3組shRNA-CXCR7腺病毒表達載體，RT-PCR和Weston Blot篩選出沉默效率最高的shRNA-CXCR7
　　2、MTT法檢測肝癌SMMC-7721細胞的增殖。
　　3、AnnexinⅤ-FITC/PI檢

8、測肝癌SMMC-7721細胞的凋亡率。
　　4、Transwell實驗檢測肝癌SMMC-7721細胞侵襲力。
　　5、RT-PCR、Western blot法檢測肝癌SMMC-7721細胞中CXCR7、Caspase-3，8和MMP-2，9的表達。
　　6、構建肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤模型。
　　7、免疫組化和Weston Blot檢測肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤瘤體標本VEGF的表達。

9、>　　8、統(tǒng)計學處理:所有數(shù)據(jù)均用Graphpad prism軟件進行統(tǒng)計分析，做圖。采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理，以P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　1、成功構建及包裝三組腺病毒載體Ad-CMV-shRNA-CXCR7-1、2、3-eGFP-1，并篩選出沉默效率最高的一組Ad-CMV-shRNA-CXCR7-3-eGFP-1用于后續(xù)實驗，病毒滴度為:3.85×108pfu/ml;
　　2、下調(diào)CXC

10、R7可增強TRAIL對肝癌SMMC-7721細胞增殖的抑制作用;
　　3、下調(diào)CXCR7增強肝癌SMMC-7721細胞對TRAIL誘導細胞凋亡的敏感性;
　　4、Transwell實驗結果顯示:TRAIL聯(lián)合shRNA-CXCR7組明顯抑制肝癌SMMC-7721細胞的侵襲;
　　5、下調(diào)CXCR7后，經(jīng)TRAIL處理，作用48h后，肝癌SMMC-7721細胞對其的敏感性增加，且明顯激活了Caspase-3，8，說明CX

11、CR7通過抑制Caspase-3，8的活化，參與了肝癌細胞SMMC-7721對TRAIL誘導凋亡的耐受;
　　6、下調(diào)CXCR7后，經(jīng)TRAIL處理，作用48h后，明顯抑制了MMP-2，9的表達，從而降低了SMMC-7721細胞的侵襲能力;
　　7、TRAIL和/或shRNA-CXCR7都可以在不同程度上抑制腫瘤的生長，但隨著時間的延長，TRAIL抑制腫瘤增長的作用明顯減弱。而實驗結束時TRAIL聯(lián)合shRNA-CXCR7組

12、裸鼠移植瘤體積增幅最小，質(zhì)量最輕。進一步通過體內(nèi)實驗證實抑制肝癌SMMC-7721細胞CXCR7的表達可進一步增強裸鼠移植瘤對TRAIL的敏感性;
　　8、TRAIL聯(lián)合shRNA-CXCR7能更顯著的降低肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤VEGF的表達。
　　結論：
　　1、本研究通過體外和體內(nèi)實驗證明，抑制肝癌SMMC-7721細胞CXCR7表達能夠明顯增強TRAIL殺傷肝癌SMMC-7721細胞的能力;