腺病毒介導(dǎo)hSulf-1表達對腫瘤細胞周期及化療敏感性影響的實驗研究.pdf

1、人硫酸酯酶1(human sulfatase1, hSulf-1)基因定位于人8號染色體長臂8q13.39,編碼一種芳香硫酸酯酶,在某些腫瘤細胞系可明顯抑制腫瘤生長遷移及增強一些抗癌藥物誘導(dǎo)的凋亡作用,因此被認為是腫瘤抑制因子。硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)是細胞外基質(zhì)的重要組成部分,能夠直接介導(dǎo)肝素結(jié)合的細胞生長因子配體和特異受體(HB-GFR)之間的相互作用。hSulf-1能夠使HSPGs脫硫酸化,抑制HSPGs介導(dǎo)的信號通路的

2、活性,進而抑制細胞的增殖、侵襲、遷移、血管增生及轉(zhuǎn)移灶的形成。除此之外,它還與細胞的粘附性、細胞骨架修復(fù)、凝血功能、以及轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β1)、Wnt/β-catenin、AKT/ERK和細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的信號通路的活性高度相關(guān)。本研究旨在構(gòu)建含有目的基因hSulf-1的多種類型腺病毒表達載體(包括非增殖型腺病毒Ad5-hSulf1、溶瘤腺病毒AdSurp-hSulf1和放射誘導(dǎo)增強型溶瘤腺病毒Ad.eSurp-hSulf1),

3、研究hSulf-1對肝癌細胞周期以及對乳腺癌化療敏感性的影響,探討hSulf-1抗腫瘤效應(yīng)及其分子機制。我們的研究為將來進行腫瘤靶向治療奠定了基礎(chǔ)。本研究分為四個部分：
　　第一部分：腺病毒載體構(gòu)建及鑒定。
　　目的：克隆 hSulf-1基因并構(gòu)建穩(wěn)定表達的非增殖型腺病毒載體Ad5-hSulf1、腫瘤特異增殖型溶瘤腺病毒載體AdSurp-hSulf1、放射誘導(dǎo)增強型溶瘤腺病毒載體Ad.eSurp-hSulf1及其相應(yīng)的攜帶綠

4、色熒光報告基因(EGFP)的陰性對照病毒Ad5-EGFP、AdSurp-EGFP、Ad.eSurp-EGFP。
　　方法：以質(zhì)粒pcDNA3.1-hSulf1為模板,設(shè)計含有BamHI和SalI酶切位點的hSulf-1基因上下游引物,采用PCR的方法擴增出含有hSulf-1基因的完整序列,將pDC315及hSulf-1基因酶切回收的產(chǎn)物連接,得到pDC315-hSulf1;以hSulf-1基因酶切回收產(chǎn)物置換pAdSurp-P53

5、中的P53序列,獲得pAdSurp-hSulf1;在pAdSurp-hSulf1啟動子Surp上游插入Egr-l基因CArG調(diào)控元件作為增強子構(gòu)建 pAd.eSurp-hSulf1。以 EGFP基因置換 pDC315-hSulf1、pAdSurp-hSulf1、pAd.eSurp-hSulf1中的hSulf1,構(gòu)建 pDC315-EGFP、 pAdSurp-EGFP、pAd.eSurp-EGFP。鑒定正確后,用 Lipofectamin

6、e2000轉(zhuǎn)染試劑,將pDC315-hSulf1、pAdSurp-hSulf1、pAd.eSurp-hSulf1分別與腺病毒包裝質(zhì)粒pBHGloxdelEl3cre共轉(zhuǎn)染 HEK293細胞中,包裝產(chǎn)生非增殖型腺病毒載體Ad5-hSulf1、溶瘤腺病毒 AdSurp-hSulf1、放射誘導(dǎo)增強型溶瘤腺病毒Ad.eSurp-hSulf1。同樣方法獲得表達EGFP的陰性對照病毒。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了非增殖型腺病毒載體Ad5-hSulf

7、1、溶瘤腺病毒載體AdSurp-hSulf1、放射誘導(dǎo)增強型溶瘤腺病毒載體Ad.eSurp-hSulf1及其對應(yīng)的陰性對照病毒,并且能夠在真核細胞中表達目的基因。
　　結(jié)論：表達hSulf-1的腺病毒載體構(gòu)建成功,為下一步研究基因的功能、探討目的基因?qū)δ[瘤細胞周期以及對化療藥物敏感性的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分：腺病毒介導(dǎo)hSulf-1表達對腫瘤細胞周期的影響。
　　目的：研究腺病毒介導(dǎo)的hSulf-1基因感染肝癌

8、和乳腺癌細胞系后,細胞周期分布的變化。
　　方法：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測hSulf-1基因在肝癌細胞系和乳腺癌細胞系中的表達情況,用流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞過表達hSulf-1基因后細胞周期分布變化。
　　結(jié)果：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測hSulf-1在肝癌細胞系SMMC-7721、MHCC-97L及乳腺癌細胞系MCF-7中低表達,流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:hSulf-1低表達腫瘤細胞感染Ad5-hSulf1后細胞周期出現(xiàn)G2/M期阻

9、滯。
　　結(jié)論：hSulf-1基因的過表達可引起腫瘤細胞周期分布變化。
　　第三部分：腺病毒介導(dǎo)hSulf-1表達拮抗bFGF引起的肝癌細胞周期變化及抗腫瘤效應(yīng)。
　　目的：研究hSulf-1拮抗bFGF引起的肝癌細胞周期變化及其抗腫瘤效應(yīng)。
　　方法：以bFGF誘導(dǎo)刺激肝癌細胞SMMC-7721和肝正常細胞WRL-68,然后感染Ad5-hSulf1;流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化,蛋白免疫印跡檢測細胞周期相關(guān)蛋白C

10、DK4、E2F的變化,MTT、Transwell、劃痕實驗分別檢測細胞增殖、侵襲和遷移能力變化。
　　結(jié)果：流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明,hSulf-1基因能夠拮抗bFGF刺激引起的細胞周期演進,誘導(dǎo)細胞周期阻滯。蛋白免疫印跡實驗結(jié)果表明bFGF刺激后的SMMC-7721細胞周期相關(guān)蛋白CDK4、E2F上調(diào),而hSulf-1可明顯拮抗bFGF的作用,下調(diào)這兩種蛋白的表達。MTT實驗結(jié)果表明,hSulf-1基因可拮抗bFGF引起的細胞增殖

11、。Transwell和劃痕實驗結(jié)果表明,hSulf-1可拮抗bFGF的作用,抑制SMMC-7721細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：hSulf-1拮抗bFGF刺激引起的肝癌細胞周期變化并且能抑制細胞的增殖、侵襲和遷移能力。
　　第四部分：腺病毒介導(dǎo)hSulf-1表達提高乳腺癌細胞MCF-7對AZD2281敏感性的研究。
　　目的：探討人硫酸酯酶-1(human sulfatase1,hSulf-1)基因重組腺病毒Ad5-h

12、Sulf1對乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移及其化療敏感性的影響。
　　方法：將重組腺病毒 Ad5-hSulf1感染 MCF-7細胞,采用不同濃度AZD2281處理細胞,并篩選AZD2281處理的最佳濃度用于后續(xù)實驗,采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期,用軟瓊脂克隆形成實驗檢測細胞克隆形成率,蛋白免疫印跡檢測細胞周期蛋白CDK4及p-AKT的表達,Transwell法、MTT法分別檢測細胞遷移及增殖能力。
　　結(jié)果：AZD2281濃度

13、為7μmol/L時對MCF-7細胞的抑制作用趨于峰值,用于后續(xù)實驗。Ad5-hSulf1+AZD2281組與AZD2281組相比,G2/M期細胞比例明顯增多,細胞克隆形成率及細胞周期蛋白CDK4的表達、AKT的磷酸化水平均明顯下調(diào),同時細胞增殖率、遷移率也有明顯下降。
　　結(jié)論：hSulf-1過表達可明顯提高乳腺癌細胞MCF-7對AZD2281的敏感性,阻滯細胞周期于G2/M期,并抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移能力,從而為乳腺癌的藥物