牛樟芝MVA途徑中基因克隆及轉(zhuǎn)錄組、代謝組研究.pdf

1、我國(guó)是食、藥用菌生產(chǎn)大國(guó)，牛樟芝（Antrodia cinnamomea）是我國(guó)臺(tái)灣著名藥用菌品種，富含三萜、腺苷、多糖等活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫力、降血糖、抗過敏、保肝等多種功效。本課題對(duì)牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建、牛樟芝菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、牛樟芝MVA途徑中基因克隆和表達(dá)量以及牛樟芝子實(shí)體、菌絲體轉(zhuǎn)錄組和代謝組進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)牛樟芝MVA途徑和相關(guān)代謝途徑中物質(zhì)差異、解決牛樟芝工業(yè)生產(chǎn)瓶頸問題。主要結(jié)論如下：
　　第一

2、，牛樟芝菌絲體在固體和液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在28℃，液體培養(yǎng)120 rpm·min，21~28 d時(shí)生物量達(dá)到最佳。收集生長(zhǎng)14 d的新鮮牛樟芝菌絲體經(jīng)10 mg·mL-1溶壁酶在30℃酶解4 h后，原生質(zhì)體得率達(dá)3.55×105個(gè)·mL-1，且再生率達(dá)4.59％；20~40%PEG-CaCl2均可介導(dǎo)牛樟芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，當(dāng)40%PEG時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高。用熒光顯微鏡和PCR對(duì)含GFP標(biāo)記及潮霉素抗性的擬轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)

3、證，結(jié)果證實(shí)該方法可將外源基因整合到牛樟芝基因組中。
　　第二，利用PB實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和RSM實(shí)驗(yàn)篩選液體培養(yǎng)牛樟芝菌絲體生物量培養(yǎng)基和牛樟芝菌絲體富萜培養(yǎng)基。結(jié)果表明，實(shí)際生產(chǎn)中牛樟芝菌絲體生物量最適培養(yǎng)基為35.16 g·L-1葡萄糖，42.86 g·L-1麥芽糖，20.80 g·L-1酵母提取物，0.39 g·L-1VB1，0.85 g·L-1殼聚糖，當(dāng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為120 rpm·min-1，培養(yǎng)15 d后菌絲體

4、生物量為1.6765±0.0103 g·100 mL-1（DW）；篩選牛樟芝菌絲體富萜最適培養(yǎng)基為：10.32 g·L-1葡萄糖，42.58 g·L-1麥芽糖，15.37 g·L-1蛋白胨，1.12 g·L-1MgSO4，0.63 g·L-1KH2PO4，0.55 g·L-1菌草靈芝水提取物（JCGLWE），當(dāng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為120 rpm·min-1，培養(yǎng)15 d后菌絲體三萜含量為34.03±1.264 mg·g-1（DW）。

5、r>　　第三，利用簡(jiǎn)并引物對(duì)牛樟芝的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（mvd）和鯊烯環(huán)氧酶（se）基因進(jìn)行RACE擴(kuò)增，gDNA全長(zhǎng)分別為1268 bp和1607 bp，分別內(nèi)含1個(gè)和3個(gè)內(nèi)含子，cDNA序列分別編碼402氨基酸和481氨基酸，并對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析不同形態(tài)及培養(yǎng)階段牛樟芝中mvd和se表達(dá)水平，結(jié)果表明培養(yǎng)7 d后菌絲體中mvd和se的表達(dá)量均達(dá)到最高，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈下降

6、趨勢(shì)，培養(yǎng)28~42 d后菌絲體中兩基因表達(dá)量趨于穩(wěn)定；菌絲體中三萜含量的測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間小于28 d時(shí)，菌絲體中三萜含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，且培養(yǎng)28 d時(shí)菌絲體的三萜含量最高，達(dá)39.192±2.025 mg·g-1，僅次于牛樟芝子實(shí)體三萜含量（49.391±2.675 mg·g-1），但菌絲體生長(zhǎng)28 d后其三萜含量降低，玉米芯栽培的牛樟芝子實(shí)體三萜含量最低（為11.530±0.733 mg·g-1），各樣品與對(duì)

7、照組間三萜含量差異達(dá)到顯著水平。
　　第四，對(duì)牛樟芝子實(shí)體（樣品1號(hào)）、液體培養(yǎng)14 d牛樟芝菌絲體（樣品2號(hào)）和液體培養(yǎng)28 d牛樟芝菌絲體（樣品3號(hào)）的轉(zhuǎn)錄組GO及KEGG分析結(jié)果表明，基因表達(dá)差異分析結(jié)果顯示樣品1號(hào)與樣品2號(hào)間差異基因有324個(gè)，富集在83條GO-term中，其中307個(gè)為下調(diào)基因，17個(gè)為上調(diào)基因；樣品1號(hào)和樣品3號(hào)間差異基因有271個(gè)，富集在78條GO-term中，其中245個(gè)為下調(diào)基因，26個(gè)為上調(diào)基

8、因；樣品2號(hào)與樣品3號(hào)間存在的差異基因?yàn)?37個(gè)，富集在46條GO-term中，其中244個(gè)為上調(diào)基因，93個(gè)為下調(diào)基因。KEGG結(jié)果表明子實(shí)體和菌絲體主要差異代謝途徑集中在碳代謝、氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、糖酵解、氨基酸生物合成等，而菌絲體間的差異代謝主要集中在脂肪酸代謝、NOD受體信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路等。結(jié)果說明不同形態(tài)牛樟芝間的碳代謝、氨基酸代謝發(fā)生了異常；而不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲體之間的脂肪酸代謝和各種信號(hào)通路發(fā)生了紊亂，其中以

9、脂肪酸代謝變化最為明顯。此外，從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩出2個(gè)較穩(wěn)定表達(dá)基因作為管家基因，并對(duì)三萜途徑中的差異基因驗(yàn)證。
　　第五，對(duì)牛樟芝子實(shí)體（樣品1號(hào)）、液體培養(yǎng)14 d牛樟芝菌絲體（樣品2號(hào)）和液體培養(yǎng)28 d牛樟芝菌絲體（樣品3號(hào)）的代謝組分析結(jié)果表明，樣品1號(hào)與樣品2號(hào)中篩選出正負(fù)離子條件下已鑒定的代謝差異物分別為21種和26種；樣品1號(hào)與樣品3號(hào)中篩選出正負(fù)離子條件下已鑒定的代謝差異物分別為14種和28種；樣品2號(hào)與樣品3

10、號(hào)中篩選出正負(fù)離子條件下已鑒定的代謝差異物分別為20種和29種。子實(shí)體與菌絲體主要代謝差異途徑包括氨基酸合成代謝、碳代謝和糖代謝，兩者間的共同差異代謝物共47種；而菌絲體間主要代謝差異途徑包括氨基酸合成和脂肪酸代謝，兩者間差異代謝物共43種。研究發(fā)現(xiàn)，子實(shí)體與菌絲體間在負(fù)離子條件下特有潛在生物標(biāo)記物有糞卟啉Ⅲ二鹽酸鹽（Coproporphyrin III）、NG,NG-二甲基-L-精氨酸（NG）、咪唑（Imidzaole）、乙?；咸寻?/p>

11、脫氫酶（UDP-N-acetylglucosamine）、尿苷二磷酸葡萄糖（Uridine diphosphate glucose）、鳥氨酸（Ornithine）6種，不同培養(yǎng)時(shí)間菌絲體之間負(fù)離子條件下特有潛在生物標(biāo)記物為 D-半乳糖，苷氨羧酸，β-D-果糖-2-磷酸鹽3種。
　　本文圍繞牛樟芝MVA途徑進(jìn)行相關(guān)研究，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選、基因克隆及表達(dá)、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等方法綜合探討牛樟芝三萜類化合物合成途徑，研究結(jié)果為進(jìn)一步挖