稻縱卷葉螟轉錄組及幾丁質(zhì)代謝途徑和抗藥性基因鑒定.pdf

1、稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)是一種重要的水稻害蟲，由于遷徙特性而難以控制，每年在長江中下游地區(qū)大量爆發(fā)。目前控制稻縱卷葉螟最主要的方法是依靠化學殺蟲劑，對環(huán)境和人類的生命安全產(chǎn)生重要影響，并且害蟲的抗藥性與日俱增。幾丁質(zhì)作為一種線型高聚物主要存在于真菌細胞壁、昆蟲表皮和圍食膜中，在昆蟲抵御外界微生物入侵中起著關鍵作用。希望通過破壞昆蟲幾丁質(zhì)代謝途徑，有利于開發(fā)殺蟲劑作用的靶點，為進一步防治稻縱卷葉螟奠定

2、基礎。迄今為止，稻縱卷葉螟在幾丁質(zhì)代謝與昆蟲抗藥性方面的報道很少。由于稻縱卷葉螟全基因組測序尚未完成，轉錄組測序成為挖掘新基因，研究基因功能的重要方法。尤其在缺乏基因組信息的情況下，可以在轉錄水平獲得特定組織、器官和個體的基因信息，極大推動了稻縱卷葉螟分子生物學的研究。
　　本研究通過對稻縱卷葉螟四齡幼蟲轉錄組測序獲得大量reads,經(jīng)過序列組裝與拼接得到Unigene；在基因注釋的基礎上鑒定幾丁質(zhì)代謝相關的酶以及代謝途徑，篩選抗

3、藥性相關的基因，為殺蟲劑新靶標的開發(fā)以及藥劑代謝機理的研究奠定基礎；充分研究轉錄組數(shù)據(jù)，發(fā)掘功能性SSR，以期獲得可供遺傳研究的分子標記。研究結果如下：
　　1．利用高通量測序技術Illumina HiSeqTM2000對稻縱卷葉螟四齡幼蟲進行轉錄組測序，獲得了29,367,797 reads，經(jīng)過Trinity軟件組裝得到相應的Contig、Transcript數(shù)量，分別為3,381,765和106,407；運用paired-e

4、nd joining和gap-filling技術拼接得到63,174個Unigene，平均堿基數(shù)為753 bp。將63,174個Unigene提交至NCBI Nr數(shù)據(jù)庫進行BLASTx比對，設置閾值E為10-5，其中注釋到COG、GO、KEGG、Swiss-prot、Nr的數(shù)量分別為8,669、18,176、10,043、24,246和31,810個，總共有32,035個Unigene得到成功注釋。
　　2．對Nr數(shù)據(jù)庫進行BLA

5、STx分析，設置閾值E為10-5,鑒定出16個與幾丁質(zhì)代謝相關的酶，包括：CHSA、CHSB、PGM、UNAP、NAGK、CHT1、CHT2、CHT3、CHT5、CHT7、Hex、CDA1、CDA2、CDA4、CDA5和CDA6，相應序列已經(jīng)在Gene Bank登錄，再結合轉錄組測序得到的KEGG pathway，以及參考相關的文獻，繪制出稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)代謝通路圖。采用 qRT-PCR驗證和檢測三個主要酶類基因：CmCHS1、CmCD

6、A1和 CmCHT1在中腸、表皮、幼蟲和成蟲中的表達量。結果表明：CmCHS1在表皮中高表達，成蟲的表達量高于幼蟲；CmCHT1在表皮中高表達，幼蟲表達量顯著高于成蟲；CmCDA1在中腸中表達，成蟲的表達量高于幼蟲。
　　3．對Nr數(shù)據(jù)庫BLASTx分析，設置閾值E為10-5，鑒定出378個分屬于15大類的昆蟲抗藥性相關的基因，包括細胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽轉移酶、γ-氨基丁酸、乙酰膽堿受體、鈉離子通道、乙酰膽堿酯酶、水

7、通道蛋白、過氧化氫酶、鈣離子通道、氯離子通道、谷胱甘肽過氧化物酶、耐甲氧普靈、超氧化物歧化酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑。
　　4．利用轉錄組獲得的數(shù)據(jù)，挖掘稻縱卷葉螟SSR分子標記，共挖掘到SSR標記位點10,394個，其中單堿基5050個，雙堿基1826個，三堿基3408個，四堿基101個，6個五堿基和3個六堿基。
　　綜合以上結果，本研究通過對稻縱卷葉螟四齡幼蟲轉錄組測序，鑒定出16種幾丁質(zhì)代謝相關的酶，分析幾丁質(zhì)代謝途徑；鑒