Ly6Chigh單核細胞動員對MSCs移植治療急性心肌梗死心肌修復(fù)的影響及機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分:巨噬細胞吞噬骨髓來源間充質(zhì)干細胞后的旁分泌作用對缺氧心肌細胞存活的影響及機制研究。
　　目的:分析LPS活化的巨噬細胞與凋亡的骨髓間充質(zhì)干細胞(dMSCs)共培養(yǎng)后，對缺氧心肌細胞的存活的影響。
　　方法:從小鼠骨髓中分離骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)缺氧盒誘導(dǎo)缺氧凋亡。巨噬細胞和凋亡的MSCs在有或無脂多糖（1微克/毫升）存在的情況下共同培養(yǎng)48小時，隨后獲取吞噬了dMSCs的巨噬

2、細胞(pMΦ);從新生小鼠獲取的心肌細胞暴露于包括pMΦ在內(nèi)的各種上清培養(yǎng)基中;MTT及線粒體膜電位檢測試劑盒用于評估心肌細胞的活性。通過ELISA和實時PCR擴增檢測巨噬細胞，骨髓間間充質(zhì)干細胞以及pMΦ上清液中細胞因子和趨化因子（TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-12，PGE2，VEGF-α，Ang-1，KGF，IGF-1，PDGF-BB和EPO）水平;將磷酸鹽緩沖液（陰性對照組）、MSCs（陽性對照組）、pMΦ（實驗1組）、

3、巨噬細胞炎性蛋白MIP-1α+pMΦ（實驗2組）注射入急性心肌梗死(AMI)后BALB/C小鼠體內(nèi)。應(yīng)用磁共振及多光譜分析儀分析移植后細胞在梗死區(qū)的定植及強度。
　　結(jié)果:活化的巨噬細胞能夠有效吞噬dMSCs;和炎癥的巨噬細胞相比，pMΦ表面的CD206表達明顯下降(P＜0.001)，而CD86的膜表面抗原的表達顯著升高(P＜0.001);pMΦ分泌TNF-α，IFN-γ,IL-12，IL-6等四種炎性細胞因子比活化的巨噬細胞明顯

4、減低(P＜0.001);pMΦ上清液中PGE2，VEGF-α，Ang-1，KGF，IGF-1，PDGF-BB和EPO水平顯著增加。吞噬了dMSCs的巨噬細胞可改善缺氧心肌細胞的生存和存活時間，表現(xiàn)為線粒體膜電位顯著增加(P＜0.01)。與陰性對照組相比，陽性對照組、實驗1組和實驗2組的細胞均可定植于梗死心肌局部，4組的相對熒光強度分別為0.001±0.010、0.037±0.020、0.056±0.018和0.071±0.026(sca

5、led counts/s);與陰性對照組比較，陽性對照組、實驗1組和實驗2組細胞移植治療后小鼠的心肌梗死面積均顯著縮小(P＜0.001)，實驗1組的心肌梗死面積占左心室面積比例顯著低于陽性對照組（P＜0.001）;四組梗死區(qū)彈性纖維占梗死區(qū)瘢痕的比例分別為(0.97±1.04)％、（1.73±0.82）％、(4.90±1.31)％和（4.78±1.87）％，
　　結(jié)論:pMΦ可提高缺氧心肌細胞生存能力和生存時間，可能與炎性細胞因子

6、分泌減少以及生長因子的分泌增多相關(guān);pMΦ可定植于梗死心肌并改善梗死后的心臟功能，其機制可能與其促進彈力纖維增生及細胞表面的抗原轉(zhuǎn)化有關(guān)。
　　第二部分:CD14++CD16+單核細胞加重心肌梗死及心肌梗死合并糖尿病患者急性心肌梗死后的心肌重塑
　　目的:評估心肌梗死后CD14++CD16+單核細胞與心肌梗死及合并糖尿病心肌梗死患者的心肌重塑的相關(guān)性
　　方法:隨機入選67例ST段抬高心肌梗死合并糖尿病的患者及65例S

7、T段抬高心肌梗死無糖尿病的患者。所有患者均在急性心肌梗死起病后12小時內(nèi)接受心肌再灌注治療。通過流式細胞儀分析患者入院后的單核細胞亞類;Q-PCR檢測每一個單核細胞亞類的趨化因子D6受體mRNA水平;Elisa試劑盒分析患者血漿中CCL2水平;3D超聲心動圖檢測所有患者心肌梗死后3天及6個月時間點的心肌梗死面積及左室射血分數(shù);使用K-M生存分析模型來比較兩組患者隨訪24個月時間內(nèi)的再發(fā)心血管事件及死亡情況;使用Cox比例風(fēng)險回歸模型排除

8、干擾因素后分析CD14++CD16+單核細胞與心肌梗死后無事件生存的相關(guān)性。
　　結(jié)果:心肌梗死合并糖尿病患者急性心肌梗死后循環(huán)中CD14++CD16+單核細胞計數(shù)與心肌梗死后6個月時間的左室射血分數(shù)及心肌梗死面積呈顯著相關(guān)(r=-0.32;p=0.008;r=0.57，p＜0.001);與無糖尿病心肌梗死患者相比，ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者CD14++CD16+單核細胞表達更低的趨化因子誘餌D6受體(p＜0.001); ST

9、抬高心肌梗死合并糖尿病患者血漿中CCL2水平更高(p＜0.001).
　　結(jié)論:CD14++CD16+單核細胞ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者的心肌重塑呈顯著相關(guān)性;CD14++CD16+單核細胞的計數(shù)與ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者的預(yù)后顯著相關(guān);相關(guān)性可能與ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者體內(nèi)較高水平的CCL2以及CD14++CD16+單核細胞低表達D6受體有關(guān)。
　　第三部分:急性心肌梗死后抑制Ly6Chigh單核細胞的動

10、員可增強骨髓間充質(zhì)干細胞的移植療效以及受損心肌的修復(fù)
　　目的:心肌梗死區(qū)域的炎癥程度與MSCs移植后的存活息息相關(guān)，因此MSCs移植過程中控制急性心肌梗死后梗死區(qū)域的炎癥顯得尤其重要，本部分研究分析AMI后通過控制Ly6Chigh單核細胞的動員對MSCs移植療效的影響。
　　方法:實驗組及對照組BALB/c急性心肌梗死模型小鼠分別皮下注射CCR2抑制劑(RS504393，2 mg/kg)和等量生理鹽水。隨后同時向兩組心肌梗

11、死小鼠梗死心肌局部注射105 EdU-標(biāo)記的MSCs。TUNEL染色試劑盒用來檢測梗死區(qū)域心肌細胞的凋亡情況。麥胚凝集素染色梗死心肌切片用來檢測梗死區(qū)域毛細血管密度，抗肌球蛋白重鏈eFluor660染色用來檢測心肌肌球蛋白陽性區(qū)域面積。細胞遷移小室用來檢測Ly6Chigh單核細胞和MSCs間的相互作用。ELISA試劑盒檢測Ly6Chigh單核細胞炎癥因子的分泌及MSCs分泌SDF-1水平。MTT法及線粒體膜電位檢測試劑盒用來分析與Ly6

12、Chigh單核細胞共培養(yǎng)后MSCs的細胞活性。
　　結(jié)果:與對照組相比，心肌梗死3天后實驗組（CCR2抑制劑組）小鼠心肌梗死區(qū)域移植MSCs的存活數(shù)量顯著增多(11.2±3.4/mm2 vs.3.5±1.6/mm2，p＜0.001)，同時凋亡的心肌細胞數(shù)量顯著減少(11.20％±3.55％ vs.20.51％±8.17％，p＜0.001)。MSCs移植后21天時可見實驗組心肌梗死小鼠梗死區(qū)域小血管的數(shù)量(139.6±21.7/mm

13、2vs.95.4±17.6/mm2，p＜0.001)及心肌肌球蛋白陽性區(qū)域面積(17.9％±6.6％vs.11.8％±3.5％，p＜0.001)均較對照組顯著增加，同時該時間點實驗組小鼠的心臟功能(LvEF％)顯著優(yōu)于對照組(50.17±10.06 vs.45.44±9.45，p＜0.001)。進一步研究分析發(fā)現(xiàn)與Ly6Chigh單核細胞共培養(yǎng)后MSCs的細胞線粒體膜電位(0.45±0.11 vs.3.4±0.3，p＜0.001)及SD

14、F-1分泌水平(80.77±39.02 pg/ml vs.435.5±77.41 pg/ml，p＜0.001)顯著減低。
　　結(jié)論:急性心肌梗死后Ly6Chigh單核細胞的動員負向影響MSCs移植后的梗死區(qū)域營養(yǎng)效應(yīng)，這可能與Ly6Chigh單核細胞分泌包括TNF-α，IL-1/6以及INF-γ等較多的炎癥因子減低了移植后MSCs的存活以及SDF-1的分泌有關(guān)。
　　第四部分:光致發(fā)光介孔納米載體荷載siCCR2抑制炎癥性單

15、核細胞遷移對心肌梗死后MSCs移植過程中MSCs移植療效的影響
　　目的:該部分研究通過使用荷載si-RNA的熒光介孔硅納米載體(PMSNs)靶向干預(yù)Ly6Chigh單核細胞的CCR2受體以期減少心肌梗死后梗死心肌局部Ly6Chigh單核細胞的浸潤，從而提升MSCs的移植療效并減輕心肌重塑。
　　方法:首先物理合成荷載siCCR2的PMSNs-siCCR2納米荷載顆粒，BALB/c小鼠心肌梗死模型制作成功后，100ulPBS

16、中105 EdU標(biāo)記的MSCs通過心肌局部注射的方式注射到梗死心肌局部。同時PMSNs-siCCR2顆粒(25μg/g)通過尾靜脈迅速注射入小鼠體內(nèi)，對照組心肌梗死小鼠僅注射等量的PMSNs納米顆粒。通過近紅外成像技術(shù)觀測PMSNs-siCCR2納米荷載顆粒在體內(nèi)的代謝及分布，最后分別在RNA、蛋白及功能水平分析PMSNs-siCCR2干預(yù)情況下MSCs的移植治療效應(yīng)。
　　結(jié)果:PMSNs-siCCR2荷載納米顆?？稍隗w內(nèi)隨著循

17、環(huán)自由流通，半衰期約37min同時未提示毒性證據(jù)。治療性的PMSNs-siCCR2納米顆粒容易富集到脾臟及循環(huán)Ly6Chigh單核細胞，與對照組相比PMSNs-siCCR2納米顆?？捎行У慕到釩CR2受體(8.04％±2.17％ vs.20.02％±4.55％，p＜0.001).隨后發(fā)現(xiàn)心肌梗死后第一天PMSNs-siCCR2顯著減少了CD11b陽性單核細胞在梗死區(qū)的聚集(49.3％±17.34％vs.61.32％±22.43％，p＜0

18、.001)。與對照組相比心肌梗死后第三天PMSNs-siCCR2組移植存活的MSCs顯著增多(13±3/mm2 vs.4±1/mm2，p＜0.001)同時梗死區(qū)域TUNEL+心肌細胞明顯減少(17.44％±6.26％ vs.39.49％±13.28％，p＜0.001)。
　　結(jié)論:PMSNs-siCCR2介導(dǎo)的Ly6Chigh單核細胞內(nèi)CCR2的基因沉默顯著增強了MSCs的移植療效，有效降低了心肌梗死后的心肌重塑，這些結(jié)果表明PM