順鉑Fe3O4納米顆粒逆轉(zhuǎn)肺癌A549-DDP細(xì)胞耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的
　　本課題旨在研究順鉑Fe3O4納米鐵顆粒(Fe3O4-MNPs-DDP)是否可以逆轉(zhuǎn)人肺癌耐藥細(xì)胞株(A549/DDP)的耐藥性，并進(jìn)一步探討Fe3O4-MNPs對A549/DDP耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用機(jī)理，為納米鐵顆粒作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法
　　將肺癌耐藥株A549/DDP細(xì)胞與不同濃度順鉑單獨(dú)或聯(lián)合納米鐵顆粒培養(yǎng)一段時(shí)間，采用甲基四唑藍(lán)法(MTT)法檢測它們對A549/DDP細(xì)胞的敏感性

2、，計(jì)算出其IC50和耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù);根據(jù)MTT檢測結(jié)果，將耐藥株A549/DDP細(xì)胞分為四個(gè)組，即對照組、20μmol/l順鉑組(DDP組)、25μg/ml納米鐵顆粒組(Fe3O4-MNPs組)和順鉑納米鐵顆粒組(20μmol/lDDP與25μg/ml聯(lián)合組，F(xiàn)e3O4-MNPs-DDP組)與不同組別培養(yǎng)一段時(shí)間后:(1)DAPI染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài);(2)流式細(xì)胞儀(FCM)檢測不同組別對A549/DDP細(xì)胞凋亡;

3、(3)電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測定A549/DDP細(xì)胞內(nèi)DDP濃度;(4)采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測A549/DDP細(xì)胞MRP1，LRP，AKT1，Bad，Bcl-2，Bax和Caspase-3mRNA表達(dá);(5)采用Westernblot法檢測MRP1，LRP，Bad，Akt1，P-Akt1和Caspase-3蛋白表達(dá);(6)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人肺癌A549/DDP細(xì)胞接種到裸鼠皮下，建立肺癌A549/DDP細(xì)胞熒光荷瘤裸鼠;(

4、8)不同組別的藥物干預(yù)成瘤裸鼠約4周，觀察裸鼠的整體熒光成像、裸鼠的生理狀況和腫瘤的大小，計(jì)算移植瘤抑制率;(9)免疫組織化學(xué)染色后，觀察腫瘤組織LRP、p53、Ki67和VEGF-c的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　(1)Fe3O4-MNPs是球形微粒，平均粒徑為30nm，當(dāng)Fe3O4-MNPs濃度小于75μg/ml時(shí)，其對Fe3O4-MNPs對A549/DDP細(xì)胞無生長抑制作用。
　　(2)單獨(dú)DDP對A549/DDP細(xì)胞的

5、抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性，其IC50為40.06μmol/l。DDP與Fe3O4-MNPs聯(lián)合作用A549/DDP細(xì)胞，細(xì)胞抑制率隨著DDP藥物濃度增加和時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，其IC50為26.26μmol/l。DDP與Fe3O4-MNPs聯(lián)合作用A549/DDP細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.52。
　　(3)經(jīng)DAPI染色，在激光共聚焦顯微鏡下，空白對照組和Fe3O4-MNPs組A549/DDP細(xì)胞具有完整的核結(jié)構(gòu)，顯示低強(qiáng)度的藍(lán)色熒

6、光數(shù)，未見典型的凋亡形態(tài)特征;在DDP組LSCM圖像上可見A549/DDP細(xì)胞染色質(zhì)濃集、空泡化、新月形、凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)，且Fe3O4-MNPs-DDP組細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征更加明顯。
　　(4)Fe3O4-MNPs-DDP組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞內(nèi)鉑含量均高于DDP組，表明Fe3O4-MNPs能有效增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)DDP濃度來誘導(dǎo)凋亡。
　　(5)Fe3O4-MNPs-DDP組細(xì)胞內(nèi)MRP1，LRP，AKT1，Bad和Bcl-

7、2mRNA表達(dá)均低于DDP組，而Bax和Caspase-3mRNA表達(dá)均高于DDP組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(6)Fe3O4-MNPs-DDP組A549/DDP細(xì)胞內(nèi)MRP1，LRP，Bad和P-Akt1蛋白下調(diào)高于DDP組，而Fe3O4-MNPs-DDP上調(diào)Akt1和Caspase-3蛋白表達(dá)高于單獨(dú)DDP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(7)不同組別的肺癌A549/DDP細(xì)胞荷瘤裸鼠經(jīng)治療后

8、，活體熒光成像分析顯示，腫瘤組織與周圍組織界限清晰，DDP組和Fe3O4-MNPs-DDP組瘤體體積均小于Fe3O4-MNPs組和空白對照組、瘤體血管明顯少于Fe3O4-MNPs組和空白對照組，且Fe3O4-MNPs-DDP組瘤體體積和瘤體血管均小于單藥DDP組。Fe3O4-MNPs-DDP組對肺癌A549/DDP細(xì)胞荷瘤裸鼠的腫瘤抑制率明顯高于DDP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(8)Fe3O4-MNPs-DDP組

9、胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的LRP陽性細(xì)胞表達(dá)率低于DDP組(P＜0.05);Fe3O4-MNPs-DDP組細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒的p53陽性細(xì)胞表達(dá)率低于DDP組(P＜0.05);Fe3O4-MNPs-DDP組胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的VEGF-c陽性細(xì)胞表達(dá)率低于DDP組(P＜0.05);Fe3O4-MNPs-DDP組細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒的Ki-67陽性細(xì)胞表達(dá)率低于DDP組(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　(1)Fe3O4-MNP

10、s可逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞A549/DDP對DDP的耐藥性;
　　(2)Fe3O4-MNPs逆轉(zhuǎn)耐藥的作用機(jī)制可能LRP和MRP1蛋白表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)DDP在細(xì)胞內(nèi)積聚有關(guān);
　　(3)Fe3O4-MNPs-DDP可能通過P13K/Akt途徑誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)A549/DDP細(xì)胞對DDP的化療敏感性，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)的效果。
　　(4)Fe3O4-MNPs-DDP能夠明顯地降低腫瘤組織內(nèi)LRP、p53以及增殖抗原Ki6