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文檔簡介
1、前列腺癌是最常見的惡性腫瘤。在美國,前列腺癌是引起男性死亡率第二高的癌癥。前列腺癌發(fā)展緩慢,它是雄激素依賴性生長腫瘤。雄激素阻斷后,前列腺癌會(huì)出現(xiàn)消退。后來出現(xiàn)了激素抵抗型癌細(xì)胞株,可抵抗常規(guī)治療手段并最終導(dǎo)致死亡。因此,開展新型的治療方法來治療激素抵抗型前列腺癌尤為重要。研究表明,滅活仙臺(tái)病毒(Hemaglutinating virus of Japan Envelope,HVJ-E)不僅可以作為載體傳遞抗腫瘤藥物,激活多重抗腫瘤免疫
2、,同時(shí)還能直接殺傷腫瘤。本研究中,我們使用HVJ-E來誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡及自噬,并初步探討了其可能的作用機(jī)制。
首先,我們用HVJ-E處理PC3細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞出現(xiàn)生長停滯、皺縮和破裂的現(xiàn)象,F(xiàn)ACS檢測顯示,經(jīng)HVJ-E處理后,PC3細(xì)胞均產(chǎn)生明顯的凋亡,且呈劑量依賴關(guān)系,提示HVJ-E可直接導(dǎo)致PC3細(xì)胞凋亡。為探討HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,我們用Western Blot法檢測了Casp
3、ase信號(hào)通路的相關(guān)蛋白,結(jié)果表明,隨著HVJ-E濃度的升高,caspase-9、caspase-3、PARP均被有效激活。為進(jìn)一步驗(yàn)證caspase通路在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中的作用,我們以廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理細(xì)胞后再用HVJ-E處理,結(jié)果顯示,caspase-3的活化被顯著抑制,同時(shí)FACS檢測結(jié)果也表明,Z-VAD-FMK可顯著抑制HVJ-E誘導(dǎo)的凋亡率。
為進(jìn)一步探究HVJ-E致PC3
4、細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,我們以Western Blot法檢測了MAPK信號(hào)通路中的3個(gè)主要亞族,結(jié)果表明p38、JNK和Erk1/2均被激活。為進(jìn)一步確認(rèn)MAPK通路在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中的作用,我們分別利用p38抑制劑SB203580(10μM)、JNK抑制劑SP600125(7.5μM)、Erk1/2抑制劑U0126(20μM)預(yù)處理細(xì)胞30分鐘后,再以HVJ-E處理PC3細(xì)胞,Western Blot結(jié)果顯示,p38、JNK和
5、Erk1/2的激活均被顯著抑制。同時(shí),F(xiàn)ACS和CCK-8的檢測結(jié)果也表明,各抑制劑可下調(diào)HVJ-E誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并減少HVJ-E導(dǎo)致的細(xì)胞死亡,證實(shí)了MAPK在HVJ-E誘導(dǎo)的PC3細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。
為深入探明HVJ-E激活MAPK信號(hào)通路的可能機(jī)制,我們測定了HVJ-E處理PC3細(xì)胞后活性氧(ROS)的產(chǎn)生水平,結(jié)果顯示,隨著HVJ-E濃度的升高,PC3產(chǎn)生ROS的水平也升高,說明HVJ-E可刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS。
6、為研究ROS在HVJ-E激活MAPK通路中的作用,我們以活性氧清除劑(NAC)預(yù)處理PC3細(xì)胞30分鐘,然后加入HVJ-E作用24小時(shí)。再經(jīng)FACS法檢測細(xì)胞凋亡率,Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,NAC能抑制HVJ-E誘導(dǎo)的凋亡率;同時(shí),NAC能抑制MAPK信號(hào)通路中JNK、Erk1/2、P38蛋白的磷酸化,提示ROS可能是HVJ-E激活MAPK信號(hào)通路,并最終導(dǎo)致PC3細(xì)胞凋亡的主要因素。
自噬在
7、細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用,為研究HVJ-E是否可引起PC3細(xì)胞自噬,我們利用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞,觀察自噬小體,并通過LC3Ⅰ/Ⅱ的轉(zhuǎn)化計(jì)算,證實(shí)HVJ-E可誘導(dǎo)PC3細(xì)胞自噬。PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路對(duì)自噬為負(fù)調(diào)控,而Ⅲ型PI3K/becline-1則對(duì)自噬形成正調(diào)控,Western Blot結(jié)果顯示,經(jīng)HVJ-E處理后,AKT、mTOR、p70S6K被激活,同時(shí)Becline-1的表達(dá)也隨著HVJ-E的
8、處理而增強(qiáng)。由此說明PI3K/Becline-1參與了HVJ-E引起的細(xì)胞自噬。為進(jìn)一步研究自噬在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中的作用,我們分別利用自噬誘導(dǎo)劑Rapa和自噬抑制劑CQ分別預(yù)處理PC3細(xì)胞,然后再以HVJ-E進(jìn)行刺激,F(xiàn)ACS和CCK-8結(jié)果表明,RAPA可提高HVJ-E致PC3細(xì)胞的凋亡率(p<0.01),而CQ對(duì)HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡率沒有影響(p>0.05);Western Blot檢測結(jié)果顯示,與HVJ-E組對(duì)照
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