BAMBI在非小細胞肺癌中的表達.pdf

1、肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，也是全球惡性腫瘤致死的首要因素。據(jù)報道，目前我國肺癌發(fā)病率每年增長26.9％。因此，加強以肺癌分子生物學等領(lǐng)域為基礎(chǔ)的肺癌病因?qū)W研究，從而探討其發(fā)病機理及治療方法具有極其重要的意義。 BAMBI基因定位在10號染色體p12.3-p11.2區(qū)域，編碼產(chǎn)物為一個由260個氨基酸組成的跨膜糖蛋白，分子量29108道爾頓，又稱作偽受體(pseudoreceptor)、NMA屬于BAMBI家族。該家族成員與

2、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、激活素(activin)等配體的Ⅰ型受體胞外區(qū)都具有相似的結(jié)構(gòu)。因此BAMBI能夠整合到配體-受體復合物中，并與TGF-βⅡ型受體形成聚合物，但由于它不具有TGF-βⅠ型受體所特有的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，所以不能磷酸化胞漿內(nèi)的Smad蛋白，從而在受體水平上阻滯TGF-β信號轉(zhuǎn)導。有研究表明，對于肺癌等上皮組織來源的腫瘤而言，TGF-β可以抑制腫瘤細胞的增殖，而BAMBI在TG

3、F-β信號通路中的負調(diào)節(jié)機制對肺癌的作用目前尚不清楚。另外，據(jù)報道BAMBI在人結(jié)腸癌、肝癌中均存在表達上調(diào)，但在非小細胞肺癌中的表達尚未明確。 目的: 檢測BAMBI在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中的表達情況，探討其與NSCLC臨床病理因素之間的關(guān)系；同時觀察BAMBI在非小細胞肺癌細胞系中的表達分布情況，并探討其表達與NSCLC病理分型及侵襲潛能之間的關(guān)系。 實驗材料與方法: 一、非小細胞肺癌組織及

4、細胞系63例NSCLC及癌旁正常組織標本用于免疫組織化學檢測。其中31例新鮮肺癌組織及癌旁正常肺組織標本，術(shù)后立即投入液氮速凍之后，于-70℃保存，用于RT—PCR檢測。三株NSCLC細胞系包括人肺腺癌細胞系A(chǔ)549、人肺巨細胞癌高侵襲潛能的亞系BEl以及人肺巨細胞癌低侵襲潛能的亞系LH7用于免疫熒光技術(shù)、RT—PCR以及Westem blot檢測。 二、半定量RT-PCR用RNAout提取總RNA，合成BAMBI、GAPDH引

5、物，應用兩步法RT-PCR試劑盒合成cDNA鏈，然后進行PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，用自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，測定條帶積分光密度值。 三、免疫組織化學染色組織經(jīng)多聚甲醛固定，制成石蠟切片進行免疫組化SP法染色，一抗1∶200稀釋，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。用顯微鏡觀察采集圖像。 四、細胞培養(yǎng) A549細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；BEl及LH7細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血

6、清的RPMI1640培養(yǎng)基。所有細胞都在37℃、5％CO<,2>條件下孵育。 五、Western blot檢測離心收集細胞，加入適量裂解液，離心取上清。蛋白定量后電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗(1∶1000)4℃過夜。次日加入二抗(1∶10000)常溫2h，加入ECL試劑暗室曝光，用自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，測定條帶積分光密度值。 六、免疫細胞熒光染色細胞爬片，用多聚甲醛固定，封閉后加入一抗(1：200)4℃過夜，次