AKT與XRCC1相互促進堿基切除修復(fù)在化療藥物耐受中的作用.pdf

1、目的：腫瘤細胞多藥耐藥性(MDR)是制約癌癥治療效果的主要因素之一。MDR發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括細胞膜上ABC家族成員蛋白的增多、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性增強、拓撲異構(gòu)酶基因的突變，以及DNA修復(fù)能力的增強等。盡管各種新的化療藥物和治療方案不斷產(chǎn)生并應(yīng)用，但在大多數(shù)最常見的惡性腫瘤中卻療效甚微，其主要原因是腫瘤細胞在接受化療藥物治療后不可避免的產(chǎn)生耐藥反應(yīng)。因此，研究腫瘤細胞多藥耐受的形成機制對干預(yù)腫瘤的耐藥反應(yīng)及增強化療藥物的療效具有重要

2、意義。
　　方法：⑴為了研究腫瘤細胞耐藥反應(yīng)的形成機制，我們首先建立了阿霉素耐受的A549細胞系(A549/DOX)和5-氟尿嘧啶耐受的HCT-8細胞系（HCT-8/5-FU），這兩種細胞株均表現(xiàn)出多藥耐受。通過免疫印跡實驗比較，比較藥物敏感細胞株和耐藥株中Akt信號通路的激活情況。⑵通過加入抑制劑的方法、免疫共沉淀實驗和激光共聚焦實驗，發(fā)現(xiàn)Akt和XRCC1之間的關(guān)系。⑶在藥物敏感的A549和HCT-8細胞中，細胞瞬時轉(zhuǎn)染XRC

3、C1或其磷酸化突變體表達質(zhì)粒。⑷利用Akt抑制劑和BER抑制劑聯(lián)合化療藥物共處理耐藥的腫瘤細胞，流式細胞術(shù)檢測凋亡率。
　　結(jié)果：兩種耐藥細胞株中Akt信號通路均呈現(xiàn)異常激活，并且耐藥細胞中堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)能力更強，化療藥物誘導(dǎo)的DNA損傷明顯減少。因此，我們繼續(xù)分析了Akt信號通路與BER之間的關(guān)系。作為活躍的DNA損傷修復(fù)途徑，BER催化的底物范圍廣泛（如烷化劑、電離輻射以及鉑類

4、藥物等形成的單功能DNA加合物等），因此BER修復(fù)功能增強與化療藥物耐藥反應(yīng)關(guān)系密切。BER是由多種蛋白、經(jīng)多步驟完成的DNA修復(fù)反應(yīng)。XRCC1是BER反應(yīng)中不可或缺的核酸修復(fù)骨架蛋白。研究表明，XRCC1對Polβ、LIGⅢ及PARP有著穩(wěn)定和調(diào)控的作用。XRCC1可以發(fā)生磷酸化翻譯后修飾，且磷酸化水平與其蛋白水平有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，與敏感細胞相比，耐藥株中XRCC1蛋白水平及其磷酸化水平均明顯增高，如果抑制Akt信號通路，則XRCC1

5、和p-XRCC1的表達明顯減少。為了進一步分析Akt和XRCC1的關(guān)系，我們通過免疫共沉淀實驗和激光共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)，Akt與XRCC1具有相互作用。此外，在對藥物敏感的A549和HCT-8細胞中過表達XRCC1或其磷酸化突變體能導(dǎo)致腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐受。最后，我們利用Akt抑制劑和BER抑制劑聯(lián)合化療藥物共處理耐藥的腫瘤細胞，由化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡明顯增加，說明Akt介導(dǎo)的BER在腫瘤細胞形成多藥耐受中具有重要作用。