高糖作用下大鼠海馬神經(jīng)元MLCK表達(dá)與MAPK-ERK通路的相關(guān)性及二苯乙烯苷對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制的探討.pdf

1、目的：建立SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)模型，確定最適的高糖作用濃度和作用時(shí)間；檢測(cè)高糖作用下海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ERK、p-ERK和MLCK的表達(dá)；探討高糖環(huán)境下海馬神經(jīng)元細(xì)胞MLCK與MAPK/ERK信號(hào)通路的相關(guān)性；初步研究高糖作用后二苯乙烯苷致MLCK表達(dá)下降的作用機(jī)制。
　　方法:1.海馬神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定：以25mM為基礎(chǔ)糖濃度培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，并用倒臵顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)；細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，通過(guò)NSE免疫

2、組化染色鑒定海馬神經(jīng)元細(xì)胞的純度，并計(jì)算海馬神經(jīng)元細(xì)胞的純度；2.最適高糖濃度探索：原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，將細(xì)胞分為25mM-24h組、25mM-48h組、25mM-72h組、45hmM-24h組、45mM-48h組、45mM-72h組；達(dá)到各組相應(yīng)的糖作用時(shí)間后，用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值，計(jì)算各組海馬神經(jīng)元的活性，得出最適高糖作用濃度。3.最適高糖作用時(shí)間的探索：原代培養(yǎng)海

3、馬神經(jīng)元細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種到玻底培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞分為25mM組、45hmM-24h組、45mM-48h組、45mM-72h組；達(dá)到各組相應(yīng)的糖作用時(shí)間后，進(jìn)行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元ERK、p-ERK和MLCK的表達(dá)，得出最適高糖作用時(shí)間。4.高糖作用后，海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ERK、p-ERK和MLCK的表達(dá)情況：原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，將細(xì)胞分為對(duì)照組和高糖組；達(dá)到高糖作用的48h后，提取蛋白，B

4、CA蛋白定量后，Western Blot檢測(cè)ERK、p-ERK和MLCK的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。5. p-ERK和MLCK相關(guān)性的探討：原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，將細(xì)胞分為高糖對(duì)照組、ERK抑制劑組和MLCK抑制劑組；其中ERK抑制劑組在高糖作用的同時(shí)加入ERK抑制劑PD98059作用24h，MLCK抑制劑組在高糖作用的同時(shí)加入MLCK抑制劑作用8h；高糖作用48h后，提取蛋白，BCA蛋白定量后，Western Blo

5、t檢測(cè)p-ERK和MLCK的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。6.二苯乙烯苷對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用：原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，將細(xì)胞分為高對(duì)照組糖組、二苯乙烯苷低劑量組（TSG-L組TSG濃度為10μmol/L）、二苯乙烯苷中劑量組（TSG-M 組,TSG濃度為50μmol/L）和二苯乙烯苷高劑量組（TSG-H組，TSG濃度為100μmol/L）；各組在高糖作用的同時(shí)加入相應(yīng)濃度的二苯乙烯苷作用24h；高糖作用48h

6、后，提取蛋白，BCA蛋白定量后，Western Blot檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元中p-ERK和MLCK的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：1.海馬神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定：海馬神經(jīng)元細(xì)胞接種后6h完全貼壁，生長(zhǎng)良好，至7天基本發(fā)育成熟，經(jīng)鑒NSE染色鑒定細(xì)胞純度達(dá)90％以上，適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.最適高糖濃度的探索：CCK-8結(jié)果顯示45mM組培養(yǎng)24h、48h、72h的海馬神經(jīng)元存活率>80%，屬1級(jí)細(xì)胞，可用于后續(xù)試驗(yàn)；60mM組培

7、養(yǎng)24h、48h和72h后，海馬神經(jīng)元存活率均<80%，不能用于后續(xù)試驗(yàn)。3.最適高糖作用時(shí)間的探索：激光共聚焦觀察海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，隨著糖濃度的升高，海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ERK熒光強(qiáng)度不變（P>0.05），p-ERK和MLCK熒光強(qiáng)度均升高（P<0.05），45mM-48h和45mM-72h組較45mM-24h組升高明顯（P<0.05），但45mM-48h組和45mM-72h組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。4.高糖作用后，海馬神經(jīng)元細(xì)

8、胞內(nèi)p-ERK和MLCK的表達(dá)情況：Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ERK表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05）,高糖組海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)p-ERK和MLCK表達(dá)明顯升高（P<0.01）；5.高糖作用下，p-ERK與MLCK的關(guān)系探討：Western Blot結(jié)果顯示，與高糖組相比，MLCK抑制劑組MLCK表達(dá)降低（P＜0.01），但p-ERK水平未有明顯變化（P＞0.05）；PD組MLCK表達(dá)及p-ERK水平均降低（P＜0.01

9、）,且兩者具有正相關(guān)性（r=0.878，P＜0.01）；6.二苯乙烯苷對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用：Western Blot結(jié)果顯示，TSG-M組、TSG-H組MLCK表達(dá)及p-ERK表達(dá)均降低（ P<0.05）， MLCK表達(dá)與p-ERK變化水平呈正相關(guān)（r=0.829，P＜0.01）。TSG-L組MLCK和p-ERK表達(dá)雖降低但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：1.糖濃度升高時(shí)海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ERK表達(dá)沒(méi)有變化，但