BDNF對高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：建立高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞模型，探討外源性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡的保護效應，及可能的細胞內(nèi)信號傳遞機制。同時建立糖尿病大鼠動物模型，探討其視網(wǎng)膜組織病理學變化，以及與視網(wǎng)膜BDNF、酪氨酸激酶受體B(Trk(B)、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)表達變化的關(guān)系，為BDNF潛在的臨床應用價值提供理論依據(jù)。
　　 方法：本研究分兩大部分進行。第一部分：1、

2、以0、5.5、15、25、35mmol/L不同濃度葡萄糖分別作用于原代培養(yǎng)的Wistar大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元24、48、72h，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法及流式細胞儀分析檢測神經(jīng)元的存活率、凋亡率，確定葡萄糖最適干預濃度及時間，建立原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元的高糖模型。2、予以75、100、125ng/mL不同濃度BDNF干預高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元96h后，采用MTT法及流式細胞儀分析檢測神經(jīng)元的存活率、凋亡率的變化，采用免疫細胞化學染

3、色法觀察BDNF受體TrkB的蛋白表達變化，確定BDNF最適干預濃度及時間。3、采用Western Blot法及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測4個不同組(正常對照組，正常對照+BDNF組，高糖模型組，高糖+BDNF組)的TrkB、ERK的蛋白及mRNA，PTrkB、PERK蛋白的表達水平，分析BDNF對高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元中TrkB、ERK磷酸化的影響。第二部分：1、建立糖尿病大鼠動物模型，以正常大鼠為對照，分別于糖尿病成

4、模后4、12、24W，采用蘇木素/伊紅(HE)染色觀察大鼠后極部視網(wǎng)膜總厚度、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)計數(shù)以及視網(wǎng)膜組織形態(tài)學變化，透射電鏡觀察糖尿病24W大鼠視網(wǎng)膜各層組織細胞的超微結(jié)構(gòu)變化。2、于糖尿病4、12、24W，采用免疫組織熒光化學法、免疫組織化學法、Western blot方法分別檢測糖尿病組與正常對照組大鼠視網(wǎng)膜GFAP、TrkB及ERK、BDNF蛋白的表達，采用RT-PCR法檢測兩組大鼠視網(wǎng)膜TrkB、ERK、BD

5、NFmRNA的表達。
　　 結(jié)果：第一部分：1、隨葡萄糖濃度的增加及時間的延長，視網(wǎng)膜神經(jīng)元的存活率下降、凋亡率增多，以35mmol/L葡萄糖干預72h的神經(jīng)元存活率(OD值：0.0268±0.0116)下降、凋亡率(40.123±7.576％)增加最為顯著(p<0.01)。2、隨著BDNF濃度的增加，高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元存活率增加、凋亡率下降，伴隨著BDNF受體TrkB蛋白表達增高，以100ng/mlBDNF干預96h組凋亡

6、率(3.458±1.531％)下降及TrkB蛋白表達增高最為顯著(p<0.05)。3、TrkB蛋白及mRNA在其它各組的表達均較正常對照組增加(p<0.05)，高糖+BDNF組比較高糖組TrkB表達亦增加(p<0.05)；ERK蛋白及mRNA表達水平在各組之間無差異(p>0.05)；PERK、PTrkB蛋白在高糖組的表達與正常對照組比較無差異(p>0.05)，正常對照+BDNF組與高糖+BDNF組比較其它2組PERK、PTrkB表達顯著

7、增加(p<0.05)，高糖+BDNF組比較其它各組PERK、PTrkB表達顯著增加(p<0.05)。第二部分：1、糖尿病組在12、24W兩個時間點與正常組相比較，后極部視網(wǎng)膜總厚度明顯變薄(60.26±4.33、52.11±5.23μm)，RGCs細胞數(shù)減少(67.57±2.59、54.93±2.02個)，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。糖尿病24W透射電鏡觀察顯示：視網(wǎng)膜RGCs及神經(jīng)膠質(zhì)細胞有凋亡征象。2、免疫組織熒光化學法檢測顯

8、示：隨病程增加，GFAP蛋白在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的表達依次增強。免疫組織化學法及RT-PCR法檢測顯示：在病程4W時糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的TrkB蛋白及mRNA表達比較正常組明顯增加(p<0.05)，12W時表達比較正常組明顯下降，24W時下降更明顯(p<0.01)；病程4、12、24W時糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的ERK蛋白及mRNA的表達均較正常組增加，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，但糖尿病各組之間比較無差異(p>0.05)。Western b

9、lot法及RT-PCR法檢測顯示：隨病程增加，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜BDNF蛋白及mRNA表達依次下降，比較正常組差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，且糖尿病各組之間也有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。
　　 結(jié)論：1、體外高糖水平可誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡。2、外源性BDNF對高糖誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡具有保護作用，并能有效上調(diào)神經(jīng)元細胞內(nèi)TrkB蛋白及mRNA、PERK蛋白、PTrkB蛋白的表達，從而可能通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活