基于高通量功能篩選的miR-451調控胃癌生物學行為的機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一部分:高通量功能篩選對胃癌細胞遷移有影響的miRNA
　　目的:
　　高通量功能篩選與胃癌細胞遷移相關的miRNA。
　　方法:
　　通過SAMcell技術在人胃癌細胞系SGC-7901中對100種miRNA進行高通量功能篩選。
　　結果:
　　確定了22種在胃癌中有功能的miRNA，其中15種抑制遷移，7種促進遷移，在抑制遷移的miRNA中，相對于對照組

2、，miR-451的差異倍數(shù)最低。
　　結論:
　　在待選miRNA中，miR-451明顯影響胃癌細胞生物學行為。
　　第二部分:胃癌組織及胃癌細胞系中miR-451的表達
　　目的:
　　檢測miR-451在胃癌組織及其配對的癌旁正常組織中的表達差異。檢測miR-451在正常胃黏膜上皮細胞株及三種胃癌細胞株中的表達量。
　　方法:
　　收集20例胃癌患者手術切除標本，利用RT-qPCR檢測miR

3、-451在胃癌組織及其配對的癌旁正常組織中的表達差異情況。提取GES-1、BGC-823、HGC-27、SGC7901細胞株中的RNA，用實時熒光定量PCR檢測miR-451的表達。
　　結果:
　　1、miR-451在癌組織中的表達顯著低于配對的癌旁正常組織。
　　2、miR-451在胃癌細胞系中的表達低于正常胃黏膜上皮細胞株GES-1。
　　結論:
　　miR-451在胃癌中表達下調，提示其可能在胃癌發(fā)

4、生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　第三部分:miR-451對胃癌細胞生物學功能的影響
　　目的:
　　研究miR-451對胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡、細胞周期、遷移、侵襲、EMT等生物學行為的影響。
　　方法:
　　應用瞬時轉染的方法將miR-451轉入胃癌細胞株以獲得高表達的miR-451的細胞模型，并用RT-qPCR驗證轉染效果;然后用CCK-8方法及EDU方法檢測腫瘤細胞的增殖情況，用Annex

5、inⅤ/PI雙染通過流式細胞儀檢測凋亡，用流式細胞儀檢測細胞周期變化，用transwell試驗檢測細胞遷移和侵襲，通過免疫熒光檢測細胞中上皮細胞標志物(E-cadherin)和間充質標志物(vimentin)的表達，來反映EMT過程。
　　結果:
　　1、選擇SGC-7901細胞作為體外細胞模型，利用Real-time qPCR檢測轉染miR-451 mimics和陰性對照48h后miR-451的表達，結果顯示:轉染miR-

6、451 mimics后SGC-7901細胞中miR-451的表達水平較陰性對照組顯著增高(P＜0.01)。
　　2、CCK8方法和EDU方法均提示在胃癌細胞SGC-7901中，miR-451表達水平的上調可抑制細胞增殖。
　　3、流式細胞儀分析雙染AnnexinⅤ和PI的SGC-7901細胞凋亡比例，結果顯示:miR-451 mimics實驗組的凋亡細胞比例為21.36％，而陰性對照組有6.87％的細胞發(fā)生了凋亡，表明miR

7、-451可以誘導胃癌細胞凋亡。
　　4、流式細胞儀檢測細胞周期，結果示:miR-451 mimics實驗組的G1/G0期、S期和G2/M期的比例分別為55.31％、21.62％和19.89％，而陰性對照組三期的比例分別為45.76％、22.97％和26.87％，表明miR-451表達水平的上調可阻滯細胞于G1期。
　　5、用transwell遷移實驗檢測過表達miR-451對SGC-7901細胞遷移能力的影響，結果示: mi

8、R-451 mimics實驗組遷移細胞數(shù)為(343.3±6.6)個，而陰性對照組為(520.6±7.6)個，兩組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明miR-451可以抑制胃癌細胞遷移。
　　6、用transwell侵襲實驗檢測過表達miR-451對SGC-7901細胞侵襲能力的影響，結果示: miR-451 mimics實驗組侵襲細胞數(shù)為(373.3±7.6)個，而陰性對照組為(523.3±13.3)個，兩組之間比較差異

9、有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明miR-451可以抑制胃癌細胞侵襲。
　　7、和陰性對照組相比，miR-451 mimics實驗組中E-cadherin的表達增高，vimentin的表達降低，表明miR-451可以起到抑制EMT過程的作用。
　　結論:
　　miR-451在胃癌細胞中發(fā)揮抑癌作用，影響胃癌的增殖、凋亡、轉移等生物學行為。
　　第四部分: miR-451靶基因的預測和驗證
　　目的:

10、　　尋找miR-451的靶基因，為深入研究miR-451的分子機制奠定基礎。
　　方法:
　　應用生物信息學軟件對miR-451的靶基因進行預測和篩選，利用雙熒光素酶報告基因方法驗證預測的靶基因，運用RT-qPCR和western blot檢測過表達miR-451后ERK2分別在mRNA和蛋白水平表達的變化。
　　結果:
　　1、應用生物信息學軟件對miR-451的靶基因進行預測，結果示:ERK2可能為miR-4

11、51的靶基因。
　　2、雙熒光素酶報告基因方法證明miR-451可以靶向作用于ERK2的3'UTR。
　　3、RT-qPCR和western blot證明SGC-7901細胞過表達miR-451后，ERK2在mRNA和蛋白水平的表達均下調。
　　結論:
　　在胃癌中，ERK2是miR-451的下游靶基因。
　　第五部分:沉默ERK2對胃癌細胞生物學功能的影響
　　目的:
　　研究miR-451的

12、下游靶基因ERK2對胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡、周期、遷移、侵襲、EMT等生物學行為的影響，分析miR-451是否是通過ERK2影響胃癌細胞生物學行為。
　　方法:
　　首先合成ERK2的siRNA，分別用實時熒光定量PCR和western blot在mRNA和蛋白水平驗證其沉默效率，應用瞬時轉染的方法將其轉入SGC-7901胃癌細胞以獲得低表達的ERK2細胞模型，然后用CCK-8方法及EDU方法檢測腫瘤細胞的增殖情

13、況，用AnnexinⅤ/PI雙染通過流式細胞儀檢測凋亡，用流式細胞儀檢測細胞周期變化，用transwell試驗檢測細胞遷移和侵襲，通過免疫熒光檢測細胞中上皮細胞標志物(E-cadherin)和間充質標志物(vimentin)的表達，來反映EMT過程。
　　結果:
　　1、RT-qPCR和Western blot結果示:轉染ERK2 siRNA后，ERK2在mRNA水平和蛋白水平的表達較陰性對照組均顯著降低。
　　2、C

14、CK8方法和EDU方法均提示在胃癌細胞SGC-7901中，沉默ERK2可抑制SGC-7901細胞增殖。
　　3、流式細胞儀分析雙染AnnexinⅤ和PI的SGC-7901細胞凋亡比例，結果顯示:si-ERK2實驗組的凋亡細胞比例為13.96％，而陰性對照組有6.87％的細胞發(fā)生了凋亡，表明下調ERK2的表達可以誘導胃癌細胞凋亡。
　　4、流式細胞儀檢測細胞周期，結果示:si-ERK2實驗組的G1/G0期、S期和G2/M期的比

15、例分別為55.29％、21.73％和19.11％，而陰性對照組三期的比例分別為45.76％、22.97％和26.87％，表明下調ERK2的表達可阻滯細胞于G1期。
　　5、用transwell遷移實驗檢測沉默ERK2對SGC-7901細胞遷移能力的影響，結果示:si-ERK2實驗組遷移細胞數(shù)為(454±12.0)個，而陰性對照組為(520.6±7.6)個，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。表明ERK2表達水平的下調可以抑制

16、胃癌細胞遷移。
　　6、用transwell侵襲實驗檢測沉默ERK2對SGC-7901細胞侵襲能力的影響，結果顯示:si-ERK2實驗組侵襲細胞數(shù)為(410.7±24.1)個，而陰性對照組為(523.3±13.3)個，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。表明ERK2表達水平的下調可以抑制胃癌細胞侵襲。
　　7、和陰性對照組相比，si-ERK2實驗組中E-cadherin的表達增高，vimentin的表達降低，表明沉默E