硼替佐米聯(lián)合去甲氧柔紅霉素誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株K562凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、一、背景白血?。菏且唤M造血干、祖細(xì)胞發(fā)生惡性改變,細(xì)胞失去進(jìn)一步分化、成熟能力,阻滯在不同的造血階段,從而導(dǎo)致的一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性腫瘤。雖然其治療水平近年來已有了明顯提高,但仍有相當(dāng)一部分患者因疾病復(fù)發(fā)或耐藥而轉(zhuǎn)變成難治的白血病,因此積極尋求新的治療方法在當(dāng)前仍然顯得尤為重要。硼替佐米(bortezomib,BOR)是一種新型抗腫瘤靶向治療藥物,目前主要用于復(fù)發(fā)或難治的多發(fā)性骨髓瘤的治療,并已顯示出良好的療效。研究顯示Bor在體外對

2、多種惡性腫瘤細(xì)胞均有抑制作用,但在白血病方面的研究報(bào)道較少,更未見與去甲氧柔紅霉素(idarubicin,IDA)聯(lián)合應(yīng)用的研究報(bào)告。本研究通過觀察Bor與Ida聯(lián)合作用于白血病細(xì)胞株K562的效果,為臨床用于治療白血病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　二、材料與方法：用硼替佐米和去甲氧柔紅霉素以指定濃度和時(shí)間分別單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)K562細(xì)胞,應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞活力,分析結(jié)果得出硼替佐米與去甲氧柔紅霉素單藥或聯(lián)合作用于K562細(xì)胞24h的細(xì)胞生

3、長抑制率;應(yīng)用Hoechst染色法對各處理組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;應(yīng)用DNA凝膠電泳法提取細(xì)胞基因組DNA通過電泳得到凋亡細(xì)胞特征性的“梯狀”(ladder)DNA條帶;用RT-PCR檢測各處理組K562細(xì)胞survivin基因及bcr/abl基因的表達(dá)趨勢;用western blot法檢測各處理組K562細(xì)胞survivin和bcr/abl-p210融合蛋白表達(dá)的變化。
　　三、結(jié)果(1)100nmol/L硼替佐米作用于K562細(xì)

4、胞24h細(xì)胞生長抑制率為40.11％,200nmol/L去甲氧柔紅霉素作用于K562細(xì)胞24h細(xì)胞生長抑制率為39.72%,兩者聯(lián)合作用于K562細(xì)胞的24h細(xì)胞生長抑制率為76.58%。兩者聯(lián)合作用時(shí)的相互作用系數(shù)(CDI)值<1,表明兩者具有協(xié)同作用。(2)陰性對照組細(xì)胞經(jīng)Hoechst染色后細(xì)胞核呈均勻、彌散的藍(lán)色熒光,而硼替佐米與去甲氧柔紅霉素單獨(dú)或聯(lián)合處理組均可見細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,表現(xiàn)為細(xì)胞核凝集、固縮,形成質(zhì)密、明亮的藍(lán)色熒光顆

5、粒;且單位視野下100nmol/L硼替佐米與200nmol/L去甲氧柔紅霉素聯(lián)合處理組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于同劑量兩者單獨(dú)處理組。(3)50-150nmol/L硼替佐米處理細(xì)胞12小時(shí),DNA凝膠電泳可見明顯DNALadder出現(xiàn),其中50nmol/L硼替佐米處理組還可見正?；蚪MDNA條帶和凋亡DNA Ladder共存。相同條件下,延長作用時(shí)間至24小時(shí),各處理組仍可見明顯DNA Ladder,但50nmol/L處理組正?；蚪M條帶消失

6、,顯示隨時(shí)間延長硼替佐米作用效果增強(qiáng)。100nmol/L硼替佐米單獨(dú)或與200nmol/L去甲氧柔紅霉素聯(lián)合處理24小時(shí),DNA凝膠電泳也均顯示出明顯DNA Ladder。(4)與陰性對照組相比,100nmol/L硼替佐米和200nmol/L去甲氧柔紅霉素聯(lián)合作用K562細(xì)胞24小時(shí)后,其survivin和bcr/abl mRNA表達(dá)水平均明顯下降。經(jīng)軟件計(jì)量分析,與陰性對照組相比,BOR+IDA兩藥聯(lián)合應(yīng)用組survivinmRNA表

7、達(dá)水平顯著下調(diào)(BOR+IDA組為:0.736±0.024,對照組為:0.895±0.023,P<0.01)。其余兩組survivin mRNA表達(dá)水平均與對照組相近(BOR組為:0.881±0.019,IDA組為:0.889±0.021,對照組為:0.895±0.023,P>0.05)。而bcr/abl mRNA表達(dá)水平亦顯著下調(diào)(BOR+IDA組為:0.440±0.020,對照組為:0.870±0.027,P<0.01)。其余兩組b

8、cr/abl mRNA表達(dá)水平均與對照組相近(BOR組為:0.858±0.015,IDA組為:0.844±0.029,對照組為:0.870±0.021,P>0.05)。(5)100nmol/L硼替佐米和200nmol/L去甲氧柔紅霉素聯(lián)合作用K562細(xì)胞24小時(shí)后,K562細(xì)胞survivin和bcr/abl融合蛋白p210的相對表達(dá)水平成下降趨勢。與陰性對照組相比,BOR+IDA兩藥聯(lián)合應(yīng)用組K562細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)水平顯

9、著降低(BOR+IDA組為:0.371±0.025,對照組為:0.871±0.032,P<0.05),其余兩組survivin蛋白表達(dá)水平均與對照組相近(BOR組為:0.862±0.017,IDA組為:0.859±0.022,對照組為:0.871±0.032,P>0.05)。與陰性對照組相比,BOR+IDA兩藥聯(lián)合應(yīng)用組p210蛋白表達(dá)水平亦顯著下調(diào)(BOR+IDA組為:0.340±0.027,對照組為:0.865±0.021,P<0.

10、01)。其余兩組p210蛋白表達(dá)水平均與對照組相近(BOR組為:0.838±0.019,IDA組為:0.8144±0.029,對照組為:0.865±0.021,P>0.05)。
　　四、結(jié)論：(1)硼替佐米聯(lián)合去甲氧柔紅霉素可通過誘導(dǎo)凋亡的方式抑制白血病細(xì)胞株K562的增殖,兩者聯(lián)合對細(xì)胞的抑制作用比同劑量兩藥任一種單獨(dú)使用時(shí)都顯著增強(qiáng)。(2)硼替佐米聯(lián)合去甲氧柔紅霉素通過抑制survivin和bcr/abl基因的表達(dá)介導(dǎo)K562