miR-199A-5p在慢性缺氧心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　慢性低氧是紫紺型先天性心臟病(cyanotic congenital heart defect，CCHD)患者的主要病理生理特征之一，同時也見于一些慢性缺血缺氧性心臟病。在長期的低氧條件下，心肌組織可以對低氧環(huán)境產(chǎn)生適應，從而維持心肌細胞存活，確保心臟的功能，患者往往可以存活數(shù)年甚至更長時間，而不發(fā)生心力衰竭。探明心肌細胞對慢性低氧適應的機制，對于CCHD及缺血缺氧性心臟病的診斷、治療尤其是CCHD患兒圍手術期針對性的

2、心肌保護具有重要的臨床意義，但目前對此機制了解尚不完全。本科室既往研究發(fā)現(xiàn)CCHD患兒心肌細胞在慢性缺氧后引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），激活活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor6，ATF6）信號途徑的未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激壓力得以緩解，避免心肌細胞損傷和凋亡，起到保護心肌細胞

3、的重要作用。另一方面，本課題組過去研究發(fā)現(xiàn)紫紺型先心病心肌組織在缺氧時激活炎癥免疫反應導致STAT3信號活化，參與了對心肌細胞的保護作用。本課題在前期研究基礎上，圍繞miR-199a-5p，及其潛在的靶基因，ATF6和78-kD葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(78-kD glucose-regulated protein，GRP78)在心肌慢性缺氧時可能的調(diào)控作用開展了深入研究，同時，對缺氧時炎癥免疫機制引起STAT3活化這一重要信號通路是否參與促進了

4、miR-199a-5p的表達下調(diào)，也進行了研究探索。
　　方法：
　　第一部分
　　收集紫紺型先天性心臟病與非紫紺型先天性心臟病(Acyanotic congenitalheart defects，ACHD)臨床患者手術中切除的心肌組織，分析ATF6（p50與p90片段）、GRP78的蛋白與mRNA表達情況，檢測心肌組織miR-199a-5p的水平，并進行其與心肌ATF6與GRP78表達水平，以及患者血氧飽和度之間的相

5、關性分析。
　　第二部分
　　利用低氧培養(yǎng)的人心肌細胞株(Human Cardiac Myocyte，HCM)作為研究模型，進行常氧與低氧培養(yǎng)，通過microRNA模擬物miR-199a-5p mimic與抑制物miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染干預細胞中miR-199a-5p的水平后，檢測ATF6、GRP78的蛋白與mRNA表達，應用流式細胞儀技術檢測AnnexinⅤ陽性的細胞凋亡率并觀察ERS凋亡相關蛋白CH

6、OP的表達情況，應用雙熒光素報告載體實驗研究在HEK293T細胞及常氧和低氧培養(yǎng)的HCM細胞中，miR-199a-5p對ATF6和GRP78的3'-UTR區(qū)的靶向作用情況。
　　第三部分
　　檢測CCHD與ACHD患兒心肌組織中白介素(Interleukin，IL)-6和IL-11的表達及STAT3磷酸化情況。將Balb/c小鼠在相當于正常大氣50％氧含量條件下的低壓低氧艙中暴露7天和21天，同時腹腔注射S3I-201干預S

7、TAT3信號的激活，檢測對miR-199a-5p水平及其前體原始microRNA即pri-miR-199a-1和pri-miR-199a-2表達的影響。利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術，研究pSTAT3與pri-miR-199a啟動子區(qū)的作用情況。此外，還觀察了缺氧小鼠注射S3I-201干預STAT3活化后，以及同時注射miR-199a-5p antagomir抑制miR-199a-5p的水平對心肌中miR-199a-5p靶基因AT

8、F6與GRP78的表達及細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.CCHD患者心肌組織中miR-199a-5p與GRP78、ATF6的表達存在相關性
　　利用手術中收集的心臟組織標本，發(fā)現(xiàn)CCHD患者心肌組織中miR-199a-5p的水平顯著低于ACHD患者，低氧后miR-199a-5p的降低與患者血氧飽和度的降低存在顯著的正相關性。CCHD患者心肌組織中ATF6、GRP78的mRNA和蛋白表達水平相對ACHD較高。同時，

9、CCHD患兒心肌組織中miR-199a-5p的水平與ATF6、GRP78的表達水平存在顯著的負相關性。
　　2.低氧培養(yǎng)的心肌細胞中miR-199a-5p下調(diào)可促進GRP78和ATF6的表達
　　通過建立人心肌細胞(HCM)的不同氧濃度（3％ O2和1％ O2）低氧培養(yǎng)模型，我們發(fā)現(xiàn)與常氧培養(yǎng)相比，中度低氧(3％O2)培養(yǎng)的HCM細胞ATF6、GRP78表達增加，UPR增強，細胞未發(fā)生明顯的凋亡反應，最接近CCHD患兒慢性低

10、氧后能生存及心肌細胞未嚴重受損的實際情況。而1％ O2培養(yǎng)的HCM細胞雖然ATF6、GRP78表達也增加，但細胞出現(xiàn)了較嚴重的凋亡，因此在3％ O2條件下培養(yǎng)HCM細胞被作為我們模擬CCHD心肌細胞的體外研究模型。
　　與常氧相比，持續(xù)的中度低氧(3％O2)可以導致心肌細胞miR-199a-5p水平數(shù)倍的降低。當將miR-199a-5pmimic轉(zhuǎn)染至3％ O2低氧培養(yǎng)的HCM中，則ATF6和GRP78的表達水平顯著降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應

11、激相關凋亡分子CHOP的表達和AnnexinⅤ+細胞凋亡率顯著增高，而miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染可導致缺氧HCM細胞ATF6和GRP78表達進一步增強和凋亡率進一步降低。上述結(jié)果提示心肌細胞低氧時miR-199a-5p的下調(diào)對ATF6和GRP78的表達具有顯著的促進作用。
　　我們通過構建含有ATF6和GRP78mRNA3'-UTR區(qū)miR-199a-5p潛在結(jié)合位點（野生型和突變型）序列的雙熒光素報告載體，與

12、miR-199a-5pmimic一起轉(zhuǎn)染進HEK293T細胞和HCM細胞，通過熒光素檢測證明了miR-199a-5p對ATF6和GRP78的3'-UTR區(qū)具有直接的靶向結(jié)合作用，且在HCM心肌細胞中這種靶向調(diào)控作用相比于HEK293T細胞具有一定的組織細胞性優(yōu)勢。另外，通過雙熒光素報告載體實驗也證明，HCM細胞低氧培養(yǎng)時，由于內(nèi)源性miR-199a-5p的水平降低，會導致miR-199a-5pmimic對ATF6和GRP78的3'-UT

13、R區(qū)的靶向作用減弱。
　　3.低氧時心肌細胞STAT3信號的活化促進了miR-199a-5p的水平下調(diào)
　　與非紫紺組相比，紫紺型先心病組心肌組織中pSTAT3/STAT3表達比值顯著增高，顯示STAT3信號活化。同時，紫紺型先心病患兒心肌組織勻漿中IL-6、IL-11的表達水平顯著高于非紫紺組，提示低氧通過誘導IL-6、IL-11等因子的生成激活心肌細胞STAT3信號。相關性分析發(fā)現(xiàn)CCHD患者心肌IL-6、IL-11的水

14、平與miR-199a-5p的水平呈顯著的負相關性。
　　小鼠低氧暴露7天和21天時miR-199a-5p的水平相比常氧小鼠出現(xiàn)數(shù)倍的降低，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)低氧導致miR-199a-5p的降低主要與其前體原始microRNA分子pri-miR-199a-2（而非pri-miR-199a-1）的表達降低有關。若小鼠在接受低氧處理同時腹腔注射STAT3特異性抑制劑S3I-201，則miR-199a-5p和pri-miR-199a-

15、2的降低被顯著阻礙。利用常氧與低氧下小鼠的心肌組織進行ChIP實驗證實，pSTAT3可以與pri-miR-199a-2的啟動子區(qū)進行結(jié)合，且低氧時這種結(jié)合性顯著增強。
　　小鼠低氧后導致心肌組織ATF6和GRP78的表達增高，但注射S3I-201干預STAT3信號后，在miR-199a-5p的水平下降被抑制的同時，miR-199a-5p靶基因ATF6和GRP78的表達增高也被抑制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡蛋白CHOP的表達增高，提示細胞

16、凋亡增多。另外，在干預STAT3信號同時如果同時給予miR-199a-5p antagomir注射抑制miR-199a-5p的水平，則ATF6和GRP78的表達相對于單獨干預STAT3時增強，凋亡分子CHOP的表達可相對被抑制。
　　結(jié)論：
　　綜合本研究結(jié)果，CCHD患者心肌細胞在長期低氧作用下，尤其是在低氧導致的心肌細胞炎癥免疫機制激活引起STAT3信號活化的情況下，miR-199a-5p的表達水平會顯著降低，導致其靶基