miR-199a-5p調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)毒性膽汁酸導(dǎo)致肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　膽汁淤積是常見的肝膽疾病，許多疾病都會(huì)引起肝內(nèi)膽汁淤積，如惡性腫瘤、膽管狹窄、免疫疾病或毛細(xì)膽管炎等。膽汁淤積本身可以導(dǎo)致肝臟急性損傷、全身炎性反應(yīng)、多器官功能障礙。膽汁淤積引起肝損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，可能包括氧化應(yīng)激反應(yīng)以及毒性膽汁酸淤積所導(dǎo)致的肝損傷，毒性膽汁酸的蓄積對(duì)肝細(xì)胞本身引起的損傷越來越得到重視，其機(jī)制就包括了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　肝細(xì)胞在許多不良刺激情況下會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊蛋白/錯(cuò)誤折疊蛋白的

2、積蓄，從而發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress），ER stress是細(xì)胞自我保護(hù)的一種反應(yīng)，但是過強(qiáng)/持續(xù)性的ER stress會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞一系列病理改變甚至引起細(xì)胞的死亡。
　　肝細(xì)胞承擔(dān)了很重的蛋白合成任務(wù)，ER保持了高效的蛋白折疊以處理新合成的蛋白。然而ER的穩(wěn)態(tài)可以為蛋白后修飾錯(cuò)誤、蛋白錯(cuò)誤折疊和病毒蛋白所打破，所有的這些都能激活未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response，UPR）通路。最新的研究證明

3、UPR在多種肝臟疾病中起到了重要的作用，例如胰島素抵抗，肝脂肪變性，酒精性肝損傷，膽汁淤積性肝病。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要激活了IRE1α、PERK、ATF6三個(gè)未折疊蛋白反應(yīng)感受元件及其各自下游通路，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在，其下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)主要通過CHOP、caspase-12、JNK通路導(dǎo)致了細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。
　　在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過程中，機(jī)體是如何調(diào)整適度應(yīng)激和過度應(yīng)激之間平衡的？又是什么機(jī)制在

4、影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的進(jìn)程？這些問題是臨床及研究工作中所亟需回答的問題。
　　microRNA是一族非編碼的RNA，可以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。它們可以特異的與mRNAs的3‘非編碼區(qū)域（3‘UTR）結(jié)合，引起mRNA的降解，抑制轉(zhuǎn)錄。近期的研究發(fā)現(xiàn)microRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)多種肝臟疾病均有重要意義。
　　miRNAs在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用和機(jī)制還不明確。有研究證明在人和老鼠肝細(xì)胞中，miR-199a的表達(dá)水平變化

5、可以改變肝病、肝癌的進(jìn)程。近來，miR-199a已被證明在腫瘤中可以靶向GRP78以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。但miR-199a在肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還不明確，有待進(jìn)一步研究。本研究擬針對(duì)在膽汁酸引起肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過程中，microRNA起到的調(diào)節(jié)作用開展工作，以進(jìn)一步揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：
　　1.通過膽總管雙重結(jié)扎建立梗阻性黃疸小鼠模型，每天觀測(cè)小鼠生存情況及體重變化，10天后收集血漿及肝臟標(biāo)本。<

6、br>　　2.毒胡蘿卜素（tunicamycin，TG）作為特異的誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的刺激因素；脫氧膽酸（DCA）作為模擬膽汁淤積時(shí)毒性膽汁酸的作用；DMSO作為陰性對(duì)照處理劑。
　　3.shRNA抑制Dicer酶，觀察microRNA是否參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控。
　　4.構(gòu)建攜帶靶基因或干擾的慢病毒，作為外源性導(dǎo)入特定基因的載體。
　　5.運(yùn)用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞的凋亡情況。
　　6.使用Targetscan、Tr

7、ansfac數(shù)據(jù)庫對(duì)靶基因相互作用的miR以及啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)。
　　7.qRT-PCR檢測(cè)樣本中miR各轉(zhuǎn)錄本水平。
　　8.Western Blot檢測(cè)樣本中蛋白分子水平。
　　9.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miRNA與靶基因mRNA3‘UTR的作用。
　　10.LDH釋放法評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡情況。
　　11.運(yùn)用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能。
　　12.ChIP法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的結(jié)合

8、情況。
　　13.HE染色、免疫組化觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬┮种艱icer基因后，膽汁酸引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的持續(xù)存在，從而引起肝細(xì)胞凋亡，說明miRNA在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解的過程中起重要的作用。
　?。ǘ﹎iRNA-199a-5p可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　1.生物信息法分析顯示miR-199a-5p可以調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中關(guān)鍵分子GRP78、ATF6、IRE1α。
　　2.膽

9、汁酸刺激可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時(shí)miR-199a-5p水平也明顯上調(diào)。
　　3.在鼠肝細(xì)胞膽汁酸刺激、鼠膽總管結(jié)扎模型中miR-199a-5p升高。
　　4.外源性、內(nèi)源性miR-199a-5p直接作用于GRP78、ATF6、IRE1α的3‘UTR（三）miR-199a-5p可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少膽汁酸刺激引起的肝細(xì)胞凋亡。
　　1.抑制miR-199a-5p表達(dá)將導(dǎo)致持續(xù)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　2.抑制miR-19

10、9a-5p的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞在DCA、TG處理后的凋亡。
　　3.miR-199a-5p通過對(duì)IRE1α的抑制保護(hù)肝細(xì)胞。
　?。ㄋ模〢P-1調(diào)控miR-199a-5p的轉(zhuǎn)錄
　　1.在TG、DCA處理后的肝細(xì)胞中，miR-199a-5p的初級(jí)轉(zhuǎn)錄體（pri-）和前體（pre-）都明顯上調(diào)。
　　2.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AP-1可能調(diào)控了MIR199A2。
　　3.DCA、TG處理后肝細(xì)胞中AP-1明顯升高

11、r>　　4.ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AP-1可以與MIR199A2的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。
　　5.JNK通路的抑制劑SP600125抑制了AP-1的激活，同時(shí)也抑制了miR-199a-5p轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致持續(xù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　6.SP600125抑制AP-1后，外源性補(bǔ)充miR-199a-5p可以同樣起到緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、保護(hù)肝細(xì)胞的作用。
　　結(jié)論：
　　本課題以DCA刺激模擬毒性膽汁酸造成的肝細(xì)胞損傷，以膽總管結(jié)扎的小鼠作為動(dòng)物模

12、型，研究毒性膽汁酸導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起肝細(xì)胞損傷的機(jī)制和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中miR-199a-5p的保護(hù)作用和調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　得到以下結(jié)論：
　　一、miR-199a-5p參與了毒性膽汁酸引起肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控。
　　二、miR-199a-5p可以靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的關(guān)鍵分子GRP78、ATF6、IRE1α的3‘UTR。
　　三、miR-199a-5p可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，在毒性膽汁酸刺激中保護(hù)肝細(xì)胞，且其保護(hù)作用主要是依

13、賴對(duì)IRE1α通路的抑制發(fā)揮的。
　　四、JNK通路激活的AP-1作為轉(zhuǎn)錄因子與MIR199A2啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合上調(diào)miR-199a-5p的表達(dá)水平。
　　五、在AP-1被抑制的情況，補(bǔ)充miR-199a-5p也能發(fā)揮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)作用保護(hù)肝細(xì)胞。
　　本研究發(fā)現(xiàn)毒性膽汁酸蓄積可以導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，其導(dǎo)致凋亡的機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)；而miR-199a-5p作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵分子GRP78、ATF6、IRE1α的調(diào)節(jié)因素