穩(wěn)定高表達(dá)FGFR1的A549細(xì)胞株的構(gòu)建及其生物活性的探究.pdf

1、目的：
　　近年來我國肺癌發(fā)病率及死亡率已居惡性腫瘤之首，不僅嚴(yán)重危害國民健康，而且對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失，肺癌的治療難點(diǎn)亟待解決。bFGF/FGFR1信號(hào)通路在肺癌的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色，以此為靶點(diǎn)的藥物是近年來的研究熱點(diǎn)。本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)FGFR1基因的A549細(xì)胞株并探究其對(duì)A549細(xì)胞生物活性的影響，為研究以FGFR1為靶點(diǎn)的抗肺癌藥物提供細(xì)胞模型。
　　方法：
　　通過構(gòu)建PCDH-FGFR1慢病

2、毒過表達(dá)載體，建立穩(wěn)定高表達(dá)FGFR1基因的A549細(xì)胞株，qRT-PCR，Western blot和免疫熒光鑒定過表達(dá)FGFR1的A549細(xì)胞株，同時(shí)制備bFGF單克隆抗體（bFGF mAb）。實(shí)驗(yàn)分為7組：A549，A549/GFP。A549/FGFR1，A549/FGFR1+AP24534（FGFR1抑制劑），A549/FGFR1+bFGF。A549/FGFR1+bFGF mAb，A549/FGFR1+bFGF+bFGF mAb，

3、用MTT法、平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖、粘附、侵襲和遷移能力，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的周期和凋亡，Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的變化。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)酶切和基因測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建了 PCDH-FGFR1慢病毒過表達(dá)載體；經(jīng)qRT-PCR、Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定，成功構(gòu)建高表達(dá) FGFR1基

4、因的A549細(xì)胞株，同時(shí)成功制備出bFGF mAb。bFGF和FGFR1可以使A549細(xì)胞由G1期向S期和G2期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞的增殖并降低細(xì)胞的凋亡；AP24534和bFGF mAb可增加 A549 G1期細(xì)胞，抑制細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。bFGF和FGFR1可以增加A549細(xì)胞粘附、侵襲和遷移能力附能力，AP24534和bFGF mAb可抑制A549細(xì)胞粘附、侵襲和遷移能力。FGFR1和bFGF可促進(jìn)Akt和mTOR磷酸化，激活PI3

5、K/Akt/mTOR信號(hào)通路，AP24534和bFGF mAb可以降低A549細(xì)胞的p-Akt和p-mTOR，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)FGFR1基因的A549/FGFR1細(xì)胞株。bFGF和FGFR1可激活 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，并且促進(jìn) A549細(xì)胞增殖、粘附、侵襲和遷移、抑制細(xì)胞凋亡；bFGF mAb和AP24534可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通