miR-203靶向SMAD3影響大鼠肝星狀細(xì)胞膠原合成與增殖.pdf

1、肝星狀細(xì)胞(HSCs)活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，活化后的肝星狀細(xì)胞是纖維性膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的主要來源。抑制HSCs活化增殖及ECM合成與沉積是目前研究抗纖維化治療的策略之一。有研究表明microRNAs(miRNAs)在HSCs活化增殖過程及ECM合成方面起到重要的調(diào)節(jié)作用。
　　目的:
　　本研究在細(xì)胞水平探索miR-203對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖及膠原合成的影響的機(jī)制研究。
　　方法:

2、　　第一部分:
　　miR-203對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖及膠原合成的影響
　　1.大鼠肝星狀細(xì)胞系(HSC-T6)分為三組:分別轉(zhuǎn)染miR-203 mimics（相似物），miR-203 inhibitor（抑制物）及無關(guān)miRNA（scramble miRNA），轉(zhuǎn)染介質(zhì)為lipofectamine2000。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h后分別提取總RNA和總蛋白;
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)每組miR-203，

3、Ⅰ型膠原蛋白(COL1A1)，Ⅲ型膠原蛋白(COL3A1)及α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）信使RNA(mRNA)表達(dá)情況;
　　3.Western Bolt檢測(cè)每組COL1A1，COL3A1及α-SMA蛋白表達(dá)情況。
　　4.MTT法檢測(cè)每組HSCs細(xì)胞增殖情況。
　　第二部分:
　　miR-203對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞SMAD3表達(dá)的影響及miR-203與SMAD3的靶向關(guān)系檢測(cè)
　　1.HSC-T6分為三組:

4、分別轉(zhuǎn)染miR-203 mimics，miR-203 inhibitor及無關(guān)miRNA（scramble miRNA），轉(zhuǎn)染介質(zhì)為lipofectamine2000。提取總RNA和總蛋白用于后續(xù)檢測(cè);
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)每組miR-203及SMAD3 mRNA的表達(dá)情況;
　　3.western blot檢測(cè)SMAD3蛋白的表達(dá)情況
　　4.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)SMAD3是miR-203的靶基

5、因，雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)miR-203與SMAD3之間的靶向關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1.miR-203 mimics組與對(duì)照組（Scramble組）相比miR-203表達(dá)明顯增加， miR-203 inhibitor組miR-203表達(dá)則顯著下調(diào);miR-203 mimics組COL1A1，COL3A1及α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)較Scramble組明顯減少，miR-203inhibitor組

6、COL1A1，COL3A1及α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)則明顯增加。
　　2.MTT試驗(yàn)結(jié)果提示上調(diào)miR-203表達(dá)抑制HSCs增殖，下調(diào)miR-203表達(dá)則促進(jìn)HSCs增殖;
　　第二部分:
　　1.miR-203 mimics組與對(duì)照組(Scramble組)相比miR-203表達(dá)明顯增加，miR-203 inhibitor組miR-203表達(dá)則顯著下調(diào);miR-203 mimics組SMAD3的mRNA及蛋白表