山莓葉萜類和酚類物質(zhì)分離、結(jié)構(gòu)鑒定及抗腫瘤活性研究.pdf

1、山莓（Rubus corchorifoliusL.f.）屬薔薇科懸鉤子屬一種落葉灌木。山莓葉具有豐富的營養(yǎng)和保健作用。本文以山莓葉為研究對(duì)象，采用溶劑萃取、柱層析和結(jié)晶等分離純化的方法對(duì)山莓葉醇提物的乙酸乙酯萃取組分進(jìn)行分離純化，并對(duì)分離純化的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。采用MTT法對(duì)分離的化合物進(jìn)行抗腫瘤活性檢測(cè)。采用流式細(xì)胞儀分析化合物對(duì)細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞線粒體膜電位和鈣離子離濃度的影響；采用Western blot分析化合物對(duì)腫瘤細(xì)

2、胞蛋白的影響，采用iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)研究新型二萜化合物作用HCT-116細(xì)胞后的蛋白組學(xué)的變化。
　　研究研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?。?）山莓葉中萜類和酚類物質(zhì)的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
　　通過溶劑萃取、常壓柱層析、中壓柱層析、薄層層析和結(jié)晶等分離純化方法，對(duì)山莓葉的乙醇提取物中乙酸乙酯萃取物進(jìn)行分離純化。采用核磁（1H-NMR、13C-NMR、HMBC、HSQC）、質(zhì)譜、X-單晶衍射分析和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)的方

3、法對(duì)分離的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明：山莓葉乙酸乙酯萃取組份共分離純化出10個(gè)化合物，分別為：16β,17-二羥基-3-氧-貝殼杉烷（1），貝殼杉烷-3α,16β,17-三醇（2），對(duì)映-貝殼杉-2-酮-16β,17,-二醇-丙酮縮酮（3)，對(duì)映-貝殼杉-3α,16β,17-三醇（4），對(duì)映-貝殼杉-16α,17二羥基-2酮（5），對(duì)映-貝殼杉-16β,17,19-三醇-3-酮（6），對(duì)映-貝殼杉烷-2α,16β,17-三醇（7）

4、，2α、3β、23-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸（8），對(duì)羥基肉桂酸乙酯（9），阿魏酸乙酯（10）。其中2個(gè)新化合物為對(duì)映-貝殼杉-2-酮-16β,17,-二醇-丙酮縮酮（3）和對(duì)映-貝殼杉-16β,17,19-三醇-3-酮（6）。首次在山莓葉發(fā)現(xiàn)了16β,17?二羥基-3-氧-貝殼杉烷（1），貝殼杉烷?3α,16β,17?三醇（2）和對(duì)映-貝殼杉?3β,16β,17?三醇（4）3個(gè)化合物。首次研究了貝殼杉烷-3α,16β,17-三醇

5、（2），對(duì)映-貝殼杉-16α,17二羥基-2酮（5）和對(duì)映?貝殼杉烷?2α,16β,17-三醇（7）3個(gè)化合物的單晶結(jié)構(gòu)。
　　（2）山莓葉中10種單體化合物的抗腫瘤活性篩選及化合物4和8的作用機(jī)制研究
　　采用MTT法檢測(cè)了分離出的10個(gè)化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2）、乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）、人胃癌細(xì)胞(SCG-7901)、人卵巢癌細(xì)胞（OVCAR3）和人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)5種癌細(xì)胞的增殖抑制作用。

6、結(jié)果表明：化合物3、4和8對(duì)HCT-116細(xì)胞具有很好的抑制作用，其IC50分別是40.00±1.78μM、29.84±2.35μM和26.84±2.12μM。化合物9和10對(duì)HepG2抑制作用的IC50分別為28.17±1.20μM和26.2±2.1μM?；衔?0在6.25~100μM時(shí)對(duì)正常LO2細(xì)胞的生長增殖沒有明顯的抑制作用，而化合物9在濃度為50μM和100μM時(shí)對(duì)LO2細(xì)胞的抑制率分別為25％和20%。化合物3在6.25~

7、100μM對(duì) CCD-18co細(xì)胞的生長沒有明顯的抑制作用;化合物4在6.25~100μM時(shí)對(duì)CCD-18co細(xì)胞和生長和增殖有輕微的抑制作用;化合物8在6.25~25μM時(shí)對(duì)CCD-18co細(xì)胞沒有明顯的抑制作用，而當(dāng)濃度為100μM時(shí)對(duì)CCD-18co細(xì)胞生長增殖具有明顯的抑制作用。采用流式細(xì)胞儀和Western blot技術(shù)研究了化合物4和8的對(duì)HCT116細(xì)胞的作用機(jī)理,結(jié)果表明：化合物4和8通過阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期、促進(jìn)

8、細(xì)胞凋亡，并能從蛋白水平上調(diào)促凋亡蛋白Cleaved PARP、Cleaved caspase-3、p53蛋白的表達(dá)和下調(diào)促周期進(jìn)程蛋白cyclin D1、p27、CDK2和CDK4的表達(dá)。
　?。?）山莓葉中阿魏酸乙酯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡及作用機(jī)制研究
　　采用顯微鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot等方法從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等方面研究阿魏酸乙酯（化合物10）對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用及其作用機(jī)制。結(jié)果

9、表明：15~35μM阿魏酸乙酯作用HepG2細(xì)胞72h時(shí),細(xì)胞數(shù)量減少，輪廓變圓，漂浮，具有濃度依賴性；而對(duì)正常肝細(xì)胞LO2沒有明顯毒性。阿魏酸乙酯作用后的HepG2細(xì)胞，經(jīng)過 DAPI染色后，與空白對(duì)照相比，細(xì)胞明顯皺縮變亮，部分凋亡細(xì)胞核還發(fā)生了裂解，程度隨濃度的增加而增加，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)。阿魏酸乙酯作用后的HepG2細(xì)胞，經(jīng)過Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其作用濃度為15μM和35μM，細(xì)胞凋亡率（

10、Annexin V-FITC+區(qū)）分別是空白對(duì)照組的1.6倍(從6.27%升至10.04%)和10倍(從6.27%升至62.95%)。阿魏酸乙酯能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，并具有濃度依賴關(guān)系。阿魏酸乙酯作用HepG2細(xì)胞后，經(jīng)過PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)阿魏酸乙酯對(duì)細(xì)胞周期具有阻滯作用,當(dāng)其濃度為15~20μM可以阻滯細(xì)胞于G0/G1期；當(dāng)濃度為25~35μM時(shí)，可以阻滯細(xì)胞于S期。阿魏酸乙酯可以降低HepG2細(xì)胞的線粒體膜電位，當(dāng)其

11、濃度從15μM升至35μM時(shí)，其細(xì)胞線粒體膜電位從29 a.u下降到14.2 a.u，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。阿魏酸乙酯能提高HepG2細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，當(dāng)濃度為15μM和35μM時(shí)分別是對(duì)照組3.0和4.5倍。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明阿魏酸乙酯作用HepG2細(xì)胞后能激活促凋亡蛋白cleaved PARP、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、p53、Bax和周期阻滯蛋白p21的表達(dá)，而抑制

12、促周期進(jìn)程蛋白cyclin D1的表達(dá)。
　?。?）山莓葉中新型二萜化合物DEK誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡及作用機(jī)制研究
　　采用顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)，從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞體膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度等方面研究新型二萜化合物對(duì)映-貝殼杉-2-酮-16β,17,-二醇-丙酮縮酮（簡稱DEK）對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡特性及抗腫瘤機(jī)制研究。結(jié)果表明：DEK誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡主要是通過作用細(xì)胞的形態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞體膜電位并將

13、細(xì)胞周期阻滯在S期。iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)分析檢測(cè)DEK作用HCT116細(xì)胞后細(xì)胞中蛋白分子表達(dá)量變化，共獲得有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異蛋白120個(gè)(P<0.05），其中53個(gè)蛋白為表達(dá)量下調(diào)，67個(gè)蛋白表達(dá)量上調(diào)。與腫瘤有關(guān)的上調(diào)和下調(diào)差異蛋白主要參與了酶調(diào)節(jié)活性、電子傳遞功能、抗氧化活性、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性，細(xì)胞的代謝、細(xì)胞生理和應(yīng)激反應(yīng)等。差異蛋白主要作用結(jié)直腸癌通路、氧化磷酸化通路、細(xì)胞周期、p53通路和Wnt等通路，在這些通路中對(duì)