丹參多糖對(duì)體外肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔的影響.pdf

1、目的：
　　所謂肝病，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)指的是以肝臟器官為解剖形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)的疾病，如病毒性急、慢性肝炎，肝硬化，脂肪肝，肝臟囊腫以及肝臟海綿狀血管瘤等等。它是一種常見(jiàn)的危害性極大的疾病。在我國(guó)肝病主要以乙型肝炎為主，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家主要以酒精性肝病為主。肝病的表現(xiàn)是很隱晦的，最突出的癥狀就是疲倦乏力和不思飲食。肝病的治療有三大原則：第一是抗病毒、第二是提高免疫力、第三恢復(fù)肝功能，在短期內(nèi)能起到抑制病毒復(fù)制、恢復(fù)肝功能、保護(hù)肝細(xì)胞等作用，但遠(yuǎn)期

2、療效不穩(wěn)定，容易反復(fù)，所以臨床上沒(méi)有治療肝病的特效藥。
　　然而中藥治療肝病有很好的療效,對(duì)病情的恢復(fù)大有幫助,明顯改善患者的生活質(zhì)量；而且中醫(yī)通過(guò)清熱解毒、涼血、活血及疏肝健脾的治療方法,改善肝功能,消除或減輕肝細(xì)胞炎癥壞死以及肝組織病理?yè)p傷的修復(fù)等,對(duì)于肝臟的整體炎癥有一個(gè)抑制或減輕的作用,能進(jìn)一步防止肝纖維化、肝硬化,改善了患者的長(zhǎng)期預(yù)后。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（Liver sinusoidal endothelial cell，LS

3、EC）屬于肝臟的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，占肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞群中44％左右。肝竇是肝臟物質(zhì)交換的場(chǎng)所， LSEC是肝竇的重要組成部分，所以肝竇內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于維持肝臟的正常功能具有十分重要的作用。脂多糖（Llipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌膜上的復(fù)合物，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如血管活性物質(zhì)內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosi

4、s Factor，TNF-α）、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)，導(dǎo)致肝細(xì)胞大量壞死與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，引起肝損傷。
　　丹參為中國(guó)的傳統(tǒng)中藥，丹參多糖（Salvia miltiorrhiza polysaccharides， SMPS）是丹參中的有效成分，有關(guān)丹參多糖對(duì)急性肝損傷的研究已有不少報(bào)道，目前大量研究丹參多糖與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞多為體內(nèi)動(dòng)物造模肝臟整體情況，如脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，很少有研究體

5、外肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。前期本課題組研究了丹參多糖對(duì)小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制與 LSEC窗孔的改變有關(guān)，為了進(jìn)一步排除肝臟內(nèi)其他細(xì)胞如枯否細(xì)胞、星狀細(xì)胞、隱藏窩細(xì)胞的影響，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)形式對(duì)體外培養(yǎng)的 LSEC進(jìn)行造模，用 LPS刺激 LSEC造成細(xì)胞損傷從而引起肝臟微循環(huán)障礙，再通過(guò)含丹參多糖的含藥血清干預(yù)已刺激的LSEC，最后檢測(cè)體外細(xì)胞培養(yǎng)中小窩蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(Alpha-sooth

6、 muscle actin,α SMA)的表達(dá)以及ET-1、NO、PGE2、TNF-α的含量，觀察其對(duì)LSEC窗孔的影響，探索窗孔的調(diào)節(jié)機(jī)制，及丹參多糖對(duì)該調(diào)節(jié)的影響。
　　方法:
　　1. SMPS含藥血清的提取
　　40只體重為180-220g的SD大鼠，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為4組，即丹參多糖高劑量組、中、低劑量組動(dòng)物及正常對(duì)照組動(dòng)物，分別以3.6g/kg、1.8g/kg、0.9g/kg的丹參多糖藥液和0.9%生

7、理鹽水連續(xù)灌胃大鼠1W，制備丹參多糖高、中、低劑量組含藥血清及正常對(duì)照組含藥血清，末次給藥2h后固定大鼠腹主動(dòng)脈取血，不加抗凝劑，室溫靜置30min，取上清。4℃3000rpm離心15min,56℃滅活30min，過(guò)0.22um微孔濾膜除菌，作好標(biāo)記-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　2. LSEC的體外培養(yǎng)刺激與干預(yù)
　?。?）傳代培養(yǎng)LSEC,將細(xì)胞懸液用吸管移入6孔板中加入培養(yǎng)液控制濃度為1.5×106/ml個(gè)細(xì)胞,分為正常對(duì)

8、照組LSEC、模型組LSEC、丹參多糖高、中、低劑量組LSEC。
　?。?）LPS刺激LSEC及SMPS含藥血清的干預(yù)：用濃度為100ng/ml的LPS刺激模型組LSEC、丹參多糖高、中、低劑量組的LSEC，正常對(duì)照組LSEC先不做處理，并將丹參多糖高、中、低劑量組含藥血清對(duì)應(yīng)加入丹參多糖高、中、低劑量組LSEC中，正常對(duì)照組含藥血清加入正常對(duì)照組、模型組LSEC中，各組含藥血清的終濃度均為10%,培養(yǎng)細(xì)胞48h后分別收集各組培養(yǎng)

9、上清液及細(xì)胞。
　?。?）各組上清液用ELISA檢測(cè)ET-1、PGE2、TNF-α的含量,用硝酸還原酶法測(cè)定NO的含量，各組細(xì)胞用Western Blot檢測(cè)Cav-1、α-SMA的表達(dá)。
　　3. LSEC電鏡樣本的制備與觀察：
　　將1*2cm的無(wú)菌蓋玻片放于6孔板中，然后將各組細(xì)胞懸液用吸管移入6孔板中，集中于蓋玻片上，放于37℃、含5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，接種2 h后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)蓋玻片后，按

10、上述刺激干預(yù)加藥方法處理48h后，將蓋玻片上各組細(xì)胞用PBS洗滌5遍后，放入1.5%的戊二醛固定液固定以制備各組電鏡樣本。
　　將固定液中的各組細(xì)胞送于南方醫(yī)科大學(xué)電鏡室，梯度酒精脫水、浸透、包埋切片和臨界點(diǎn)干燥的制作都電鏡室專(zhuān)業(yè)老師完成。
　　結(jié)果：
　　1.與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞Cav-1、α-SMA的表達(dá)量顯著增多（P<0.01）。與模型組相比，丹參多糖組細(xì)胞Cav-1、α-SMA的表達(dá)量顯著減少（P<0.

11、05）。且丹參多糖高、中劑量組Cav-1、α–SMA表達(dá)減少量幅度較低劑量組明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.模型組上清液TNF-α、PGE2的含量與正常對(duì)照組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），丹參多糖組TNF-α、PGE2的含量與模型組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且丹參多糖高、中劑量組TNF-α、PGE2的含量降低幅度較低劑量組明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

12、　　3.模型組上清液ET-1、NO的含量與正常對(duì)照組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），丹參多糖組ET-1、NO的含量與模型組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且丹參多糖高、中劑量組NO的含量降低幅度較低劑量組明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4.與正常對(duì)照組相比，模型組的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔數(shù)目明顯減少、孔徑縮小、面積減少，丹參多糖組肝竇內(nèi)皮細(xì)胞較模型組窗孔數(shù)目顯著增多、孔徑增大、面積變大。其

13、中高、中劑量SMPS的作用效果更顯著。
　　結(jié)論：
　　LPS刺激LSEC造成細(xì)胞損傷，導(dǎo)致Cav-1、α SMA表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)LSEC分泌合成ET-1、NO、PGE2、TNF-α，使其含量增多，其含量的增加也會(huì)反過(guò)來(lái)?yè)p傷LSEC，這是一個(gè)正負(fù)反饋。同時(shí)LSEC的窗孔明顯數(shù)目、孔徑、面積減少，窗孔幾乎消失。予SMPS干預(yù)后Cav-1、α SMA表達(dá)下調(diào)，ET-1、NO、PGE2、TNF-α的含量降低，并且肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔數(shù)目