人參皂苷(s)Rh2通過HDAC6調(diào)控人白血病細(xì)胞自噬凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、白血病是嚴(yán)重危害人類健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是國(guó)內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一。其細(xì)胞學(xué)特征是造血細(xì)胞增殖失控、分化障礙、細(xì)胞凋亡受阻，以致大量分化異常的白血病細(xì)胞增殖。目前，白血病的治療仍采用大劑量藥物聯(lián)合化療，不但費(fèi)用昂貴，而且副作用甚大，尤其對(duì)機(jī)體免疫和造血系統(tǒng)損害極大，復(fù)發(fā)率較高。因此，我們急需尋找一種高效低毒的抗白血病天然藥物。
　　人參是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，在腫瘤的治療方面具有很高的藥用價(jià)值， S型人參皂苷單體Rh2（(s)Rh2

2、）是人參中天然活性成分之一，對(duì)卵巢癌、胃癌、肝癌和白血病等多種腫瘤細(xì)胞都有增殖抑制、誘導(dǎo)分化和促進(jìn)凋亡的作用，具有強(qiáng)抗腫瘤活性和低毒性的特點(diǎn)。
　　近來研究表明，組蛋白去乙?；?Histone deacetylases，HDACs)的異常表達(dá)與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，組蛋白去乙?；副徽J(rèn)為是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。在眾多組蛋白脫乙酰化酶中HDAC6是比較特別的，因?yàn)槠浼瓤稍诩?xì)胞核中參與組蛋白的乙?；揎?，又可在細(xì)胞質(zhì)

3、中參與非組蛋白的乙?；揎?，并在白血病中高表達(dá)，故我們認(rèn)為抑制HDAC6的異常表達(dá)可成為治療白血病的關(guān)鍵策略之一。
　　目前認(rèn)為，細(xì)胞死亡包括3種類型：即壞死、凋亡和自噬性細(xì)胞死亡。自噬的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可以從不同生物學(xué)行為影響腫瘤的進(jìn)程，其中有細(xì)胞周期、增殖、凋亡、耐藥、血管生成及腫瘤的治療等方面的調(diào)控。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蛋白乙?；腿ヒ阴；梢杂绊懠?xì)胞自噬體的形成，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，這為治療腫瘤提供新的

4、思路。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)以人白血病細(xì)胞 K562和 KG1α為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究(s)Rh2對(duì)K562和KG1α細(xì)胞增殖、自噬凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。
　　目的：
　　研究人參皂苷單體(s)Rh2對(duì)人白血病K562和KG1α細(xì)胞株增殖、自噬和凋亡的影響，初步從組蛋白乙?；揎椃矫嫣接?s)Rh2對(duì)K562和KG1α細(xì)胞中HADCs的影響及HDAC6調(diào)控自噬凋亡的機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分
　　采

5、用CCK-8的方法在人參總皂苷和人參皂苷單體Rb1、Rg1、Re、(R)Rg3、(s)Rh2中篩選對(duì)人白血病K562和KG1α細(xì)胞株藥效最佳的人參活性成分。采用吖啶橙和MDC染色觀察(s)Rh2對(duì)細(xì)胞自噬的影響。用 RT-PCR檢測(cè)(s)Rh2對(duì)白血病細(xì)胞自噬重要基因的表達(dá)的影響。用Western Blot檢測(cè)(s)Rh2對(duì)白血病細(xì)胞自噬和凋亡重要蛋白的表達(dá)的影響。加入自噬抑制劑后，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，流式測(cè)細(xì)胞凋亡， West

6、ern Blot檢測(cè)細(xì)胞自噬凋亡蛋白的表達(dá)。
　　第二部分
　　采用化學(xué)比色法比較HAT和HDAC酶活性。運(yùn)用Western Blot和RT-PCR法檢測(cè)人參皂苷單體(s)Rh2對(duì)細(xì)胞 HDACs表達(dá)、組蛋白 H3乙?；妥允傻蛲鲋匾虻鞍妆磉_(dá)的影響。構(gòu)建HDAC6 siRNA的慢病毒質(zhì)粒感染人白血病 K562和 KG1α細(xì)胞株，并篩選出穩(wěn)定表達(dá)的siHDAC6細(xì)胞株。分別用人參皂苷單體(s)Rh2處理siHDAC6的K5

7、62和KG1α細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的K562和KG1α細(xì)胞作為對(duì)照。用臺(tái)盼藍(lán)染色、FCM及Hoechst染色檢測(cè)下調(diào)HDAC6后(s)Rh2對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響；用RT-PCR檢測(cè)下調(diào)HDAC6后人參皂苷單體(s)Rh2對(duì)HDAC6、Hsp90 mRNA表達(dá)水平的影響；用Western Blot檢測(cè)下調(diào)HDAC6后(s)Rh2對(duì)Hsp90、Beclin-1、激活型Caspase-3、LC3A和LC3B蛋白表達(dá)的影響。
　　第三部

8、分
　　建立人白血病 K562細(xì)胞裸鼠異體移植瘤模型，人參皂苷(s)Rh2灌胃，對(duì)照組用生理鹽水灌胃。測(cè)量腫瘤直徑、體積和計(jì)算抑瘤率，檢測(cè)人參皂苷(s)Rh2在體內(nèi)的抗腫瘤活性；HE染色觀察細(xì)胞凋亡，免疫組化檢測(cè)HDAC6，Hsp90和激活型的Caspase3蛋白表達(dá)水平；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)瘤組織內(nèi)HDAC和HAT的活性；RT-PCR檢測(cè)自噬重要基因和 HDAC6， Hsp90的 mRNA表達(dá)水平；Western blot法檢測(cè)HDA

9、C1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8結(jié)果顯示：人參皂苷單體(s)Rh2對(duì)K562和KG1α細(xì)胞增殖抑制效果最佳，其抑制作用呈濃度依賴性；
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：(s)Rh2(60μmol/L)可誘導(dǎo) K562和KG1α細(xì)胞的早期凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Western blot結(jié)果顯示，Bax、Caspase-3（激活型）隨

10、(s)Rh2濃度的增加呈上調(diào)趨勢(shì)；
　　3.吖啶橙和MDC染色結(jié)果顯示：(s)Rh2可引起細(xì)胞內(nèi)的酸性自噬小泡增多，導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平增高；RT-PCR和Western-Blot結(jié)果顯示：(s)Rh2組細(xì)胞自噬關(guān)鍵分子表達(dá)增高；
　　4.HAT和 HDAC酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示：高濃度的(s)Rh2（60μmol/L）能提高K562和KG1α細(xì)胞中組蛋白乙酰化酶（HAT）的活性和降低組蛋白去乙?；福℉DAC）的活性；
　　

11、5.Western blot結(jié)果顯示：隨(s)Rh2濃度的增加，HDAC1、HDAC2、HDAC6蛋白的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，H3蛋白的乙?；匠噬险{(diào)趨勢(shì)；
　　6.臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示：干擾 HDAC6基因的表達(dá)，能有效抑制K562和KG1α細(xì)胞的增殖，并增加K562和KG1α細(xì)胞對(duì)人參皂苷單體(s)Rh2的敏感性；
　　7.FCM和Hoechst染色結(jié)果顯示：干擾HDAC6基因的表達(dá)，能促進(jìn) K562和 KG1α細(xì)胞凋亡，并增

12、強(qiáng)人參皂苷單體(s)Rh2對(duì) K562和KG1α細(xì)胞的促凋亡作用；
　　8.Western blot結(jié)果顯示：(s)Rh2可降低HDAC6和Hsp90表達(dá)，上調(diào)自噬的重要蛋白Beclin-1、LC3A、LC3B和激活型Caspase-3的表達(dá)；
　　9.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示：人參皂苷(s)Rh2能抑制K562細(xì)胞異體移植瘤的生長(zhǎng)，抑制率達(dá)53.10％；人參皂苷(s)Rh2能明顯降低瘤體內(nèi)HDAC的活性和降低HDAC1、HDAC2、

13、HDAC6表達(dá)水平；人參皂苷(s)Rh2能抑制Hsp90的表達(dá)，并增加自噬重要基因Beclin-1、LC3A和LC3B的表達(dá)；組織病理學(xué)結(jié)果顯示人參皂苷(s)Rh2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.人參皂苷(s)Rh2在低濃度時(shí)能有效抑制白血病細(xì)胞增殖，且其抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性，較人參總皂苷和其他人參單體抑制效果為最好；
　　2.人參皂苷(s)Rh2能促使白血病細(xì)胞發(fā)生自噬，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡；

14、r>　　3.人參皂苷(s)Rh2能夠抑制HDAC的活性，增加HAT的活性及降低 HDAC1、HDAC2、HDAC6蛋白的表達(dá)，從而促使 K562和KG1α細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；皆黾?，這可能與其抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡的機(jī)制有關(guān)聯(lián)；
　　4.下調(diào)HDAC6的表達(dá)協(xié)同人參皂苷單體(s)Rh2主要通過Hsp90通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)人白血病細(xì)胞的抑制增殖，誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)凋亡作用；
　　5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明(s)Rh2能通過HDAC6，H