人參皂苷Rh2對人乳腺癌細胞多藥耐藥的逆轉作用及其相關機制的實驗研究.pdf

1、乳腺癌的發(fā)病率呈每年上升的趨勢，在女性惡性腫瘤死亡原因中占第二位。它是一類危害婦女健康的主要惡性腫瘤，其常規(guī)的治療方法主要有化療、放療、手術和內分泌治療等,但是與其它的很多惡性腫瘤一樣，乳腺癌的多藥耐藥(mulfidrugresistance，MDR)特性嚴重地限制了化療的實施。
　　腫瘤細胞對抗癌藥物產生耐藥性，尤其是多藥耐藥性，是惡性腫瘤化療失敗的主要原因，也是腫瘤化療領域中急需解決的難題。乳腺癌的多藥耐藥是指腫瘤細胞對某種抗

2、腫瘤藥物產生耐藥的同時，對作用機制和結構完全不同的其它抗腫瘤藥物也存在耐藥的特性，它形成的機制主要包括腫瘤細胞減少對藥物的迸入而泵出藥物相對增多，藥物靶點的改變，細胞周期檢測點的紊亂，DNA損傷修復系統(tǒng)障礙以及細胞凋亡途徑變化等?？朔嗨幠退幱袃煞N方法首先是開發(fā)對MDR腫瘤細胞不具有抗藥性的新抗癌藥物，其次是尋找MDR逆轉劑與抗癌藥物合用，恢復MDR腫瘤細胞對抗癌藥物的敏感性。雖然目前有很多乳腺癌多藥耐藥逆轉劑在動物模型和體外細胞培養(yǎng)中

3、都具有很好的逆轉功效，但是在實際的臨床實驗中，這些耐藥逆轉劑由于干擾傳統(tǒng)的抗癌藥物藥代動力學、還由于因可引起嚴重的毒副作用等，至今都沒有取得預期的臨床效果，因此急需開發(fā)新的有效逆轉劑來逆轉MDR。
　　P-gp是多藥耐藥基因-1(multidrug resistance gene-1，MDR-1)編碼的一種跨膜轉運蛋白，能將化療藥物從細胞內泵出，降低細胞內的有效藥物濃度從而導致多藥耐藥，具有 ATP酶活性。 EMMPRIN（ext

4、racellular matrix metalloproteinase inducer，CD147，basigin)為單次跨膜糖蛋白，在腫瘤細胞表面高表達，是免疫球蛋白超家族成員，能促進成纖維細胞或腫瘤細胞產生MMPs，和腫瘤的浸潤轉移密切相關?；|金屬蛋白酶(matrix metaloproteinases，MMPs)是目前已知的能夠降解膠原纖維的唯一酶類，參與腫瘤細胞對細胞外基質(extracellular matrix，ECM)和

5、基底膜(basement membrane，BM)的降解，是一族鋅肽酶超家族?；|金屬蛋白酶在很多轉移癌中的表達明顯增高，與腫瘤轉移密切相關。基質金屬蛋白酶成員中，基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)因為能夠特異性地降解細胞基底膜和細胞外基質的主要成分IV型膠原，從而在腫瘤侵襲轉移過程中發(fā)揮最重要和最

6、直接的作用。
　　耐藥的腫瘤細胞與敏感細胞相比，表達更高的CD147和MMPs，同時還發(fā)現(xiàn)P-糖蛋白底物能促進耐藥腫瘤細胞的EMMPRIN和MMPs表達，增強腫瘤細胞的浸潤轉移能力，這些實驗表明臨床上不恰當?shù)幕煂δ[瘤患者的病情產生不利的影響，還有可能促進癌細胞的浸潤轉移。用有效逆轉多藥耐藥的藥物逆轉腫瘤耐藥，能否同時影響腫瘤的浸潤轉移特性，目前文獻報道甚少。
　　中藥治療腫瘤不僅作用途徑比較廣泛，而且毒副作用小。近年來，大

7、量的實驗研究表明，許多復方制劑及單味中藥的有效成分在體外實驗中有逆轉腫瘤細胞MDR的作用。人參皂苷Rh2（Ginsenoside-Rh2）具有抗衰老、抗疲勞、抗血小板聚集、抗輻射等多種生物功能，是五加科人參屬植物的主要活性成分。隨著研究的深入，該類化合物在癌癥的治療和預防方面具有很強的活性。人參皂苷可通過多種機制發(fā)揮其抗腫瘤活性，如逆轉耐藥，提高化療藥物敏感性；直接抑制瘤細胞的生長；誘導瘤細胞的凋亡及分化；作用于腫瘤侵襲的多個環(huán)節(jié)抑制腫

8、瘤的轉移；影響代謝和調節(jié)免疫功能；也可通過影響細胞內多種酶活性，增強機體對疾病的抵抗能力，從而間接地抑制腫瘤的生長。
　　針對人參皂苷逆轉 MDR的作用，研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg3可以增加 KBV20C對多種化療藥物的敏感性；并且抑制了羅丹明123從KBV20C細胞內的外排。人參皂苷 Rh2在實驗所選定的劑量下對 B16-BL6細胞自發(fā)性肺轉移具有明顯的抑制作用，其作用機制與抑制基質金屬蛋白酶有關，并證明人參皂苷 Rh2對正常細胞

9、毒性作用甚低。但有關人參皂苷Rh2逆轉腫瘤耐藥的同時影響腫瘤的浸潤轉移作用的研究尚未見報導，因此，本研究以耐阿霉素乳腺癌細胞系(MCF7/AdrR)作為靶細胞，研究人參皂苷 Rh2對耐藥細胞的耐藥逆轉作用，并從誘導耐藥細胞的凋亡及人參皂苷Rh2對耐藥侵襲轉移相關基因表達的影響，闡明人參皂苷Rh2逆轉耐藥的可能機制。
　　實驗結果如下：
　　1. MTT檢測結果顯示5～40 mol/L的GS-Rh2對MCF7/Adr無明顯細胞

10、毒作用，細胞存活率大于90％，MCF7/Adr對0.2～1.0μg／mL的ADM完全耐受，細胞存活率大于95％。
　　2.檢測結果顯示5～40μmol/L的人參皂苷Rh2與1.0μg/mL的ADM聯(lián)合應用，細胞存活率明顯下降，細胞存活數(shù)分別是單用ADM組的63%，50%，31%，28%，通過流式細胞儀檢測細胞內熒光強度發(fā)現(xiàn)，5～40μmol/L的人參皂苷 Rh2與1.0μg/mL的ADM聯(lián)合應用細胞，細胞內ADM的熒光強度明顯升高

11、，細胞內ADM熒光強度分別是 ADM單獨作用組的1.09，1.55，1.61，2.37倍，其差異均具有顯著性意義。
　　3.熒光顯微鏡顯示MCF7/AdrR細胞經GS-Rh2作用后呈較明顯的凋亡形態(tài)學改變，ADM+Rh2不同濃度組細胞核數(shù)目明顯減少，有大量固縮變形的細胞核，染色質濃縮，表現(xiàn)為濃染致密的熒光顆粒，有凋亡小體形成,尤其ADM與Rh2大劑量聯(lián)合用藥組凋亡最明顯。
　　4.流式細胞儀檢測證實，GS-Rh2能在一定濃度

12、范圍內誘導MCF7/AdrR細胞凋亡，GS-Rh2與ADM聯(lián)合作用組的凋亡率為(47.08％)，高于對照組(8.51％)和阿霉素組(15.20％)(P均<0.05)。Rh2+ADM各濃度組作用于MCF7/AdrR細胞株均出現(xiàn)誘導G0/G1期阻滯，阻滯細胞由G1期向S期的轉化，隨Rh2作用濃度的增加G0/G1期細胞含量上升，S期細胞下降，G2/M期與對照組比較無明顯的變化。
　　5. Rh2組和ADM組的Fas、Bax、Bcl-2、

13、Bcl-xL蛋白表達與對照組比較差異無統(tǒng)汁學意義。ADM+Rh2不同濃度組作用于MCF7/AdrR細胞使Fas、Bax蛋白的表達增高，Rh2濃度為40μmol/L時蛋白表達增高最明顯，Bcl-2蛋白的表達降低，Bcl-xL蛋白的表達在藥物作用前后無明顯的變化。
　　6.首先 RT-PCR和 Western blot檢測結果顯示1.0μg/mLADM作用于MCF7/Adr細胞，與對照組相比，細胞P-gp、EMMPRIN和MMP1、M

14、MP2、MMP9蛋白和mRNA水平升高，進而又觀察了人參皂苷Rh2對細胞P-gp、EMMPRIN和MMP1、MMP2、MMP9表達的影響。結果顯示當人參皂苷Rh2與ADM聯(lián)合應用時，人參皂苷Rh2也能明顯抑制ADM對細胞上述蛋白和mRNA水平的上調，且人參皂苷Rh2對上述蛋白表達的下調與人參皂苷Rh2濃度相關，呈濃度依賴性。
　　7.人參皂苷Rh2作用于MCF7/Adr細胞后，經transwell chamber實驗檢測，結果發(fā)現(xiàn)

15、 ADM+Rh2不同濃度組與對照組相比細胞穿過覆蓋 Matrigel或沒有覆蓋Matrigel帶孔濾膜的數(shù)目均有所減少；與對照組相比人參皂苷 Rh2明顯抑制了MCF7/Adr細胞侵襲與轉移，其抑制率分別為16%、26%、49%、74%和18%、23%、52%、78%。而ADM組與對照組相比，MCF7/Adr細胞穿過覆蓋 Matrigel或沒有覆蓋Matrigel帶孔濾膜的數(shù)目增多。
　　以上結果提示：1.人參皂苷 Rh2可以有效逆

16、轉乳腺癌細胞耐藥細胞系MCF7/ADM的耐藥性，是一種安全、高效的MDR逆轉劑。其耐藥逆轉作用與 P-gp有關,人參皂苷Rh2有可能直接或間接作用于P-gp，使其功能減退或失活,Rh2作為鈣通道阻滯劑與抗腫瘤藥物競爭 P-gp的結合位點，從而抑制其跨膜泵作用，使抗腫瘤藥物的細胞外排降低，提高細胞內藥物濃度而逆轉耐藥。2. GS-Rh2能抑制體外培養(yǎng)的MCF7/AdrR細胞增殖并誘導其凋亡。3.誘導MCF7/AdrR細胞凋亡可能是通過上調