PGI基因?qū)Π籽〉挠绊懞蜋C(jī)制的研究及Rh2對(duì)白血病影響的機(jī)制和抑制PGI的關(guān)系.pdf

1、背景及目的:
　　白血病是高發(fā)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。其特點(diǎn)為正常造血細(xì)胞受到某一類型的白血病細(xì)胞的抑制，骨髓或其他造血組織中白血病細(xì)胞惡性增生，浸潤(rùn)體內(nèi)各組織臟器，產(chǎn)生各種臨床癥狀。治療以化療、骨髓移植為主，某些類型白血病化療耐藥，治療效果差，預(yù)后較差。
　　磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(phosphoglucose isomerase，PGI)作為一種多功能蛋白廣泛存在于各種組織中，在細(xì)胞內(nèi)是催化糖酵解和糖異生途徑葡萄糖-6-磷酸酶與果

2、糖-6-磷酸酶之間的相互轉(zhuǎn)化的一種關(guān)鍵酶[1]。因?yàn)槟鼙患?xì)胞分泌到胞外作用于周圍細(xì)胞發(fā)揮各種作用被稱作自分泌活動(dòng)因子(autocrine motility factors，AMF)[2-4]。它的激活促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的活性。我們的前期研究表明，用人參多糖GPS作用于白血病細(xì)胞，其PGI基因能被明顯的抑制[5]。為研究下調(diào)PGI后與白血病的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，我們構(gòu)建了共表達(dá)熒光蛋白和人PGI基因siRNA的慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染高表

3、達(dá)PGI基因的人白血病細(xì)胞，初步觀察RNA干擾PGI基因?qū)Π籽〖?xì)胞生物學(xué)特性的影響及其可能的機(jī)制，同時(shí)加入人參皂苷單體Rh2，觀察其對(duì)白血病細(xì)胞的作用與抑制PGI的關(guān)系。
　　方法:
　　第一部分
　　提取并收集人正常單核細(xì)胞，收集白血病細(xì)胞K562、KG1-α、HL60細(xì)胞，RT-PCR、Western Blot檢測(cè)PGI在人單核細(xì)胞及白血病細(xì)胞中的表達(dá)情況，篩選出高表達(dá)PGI的白血病細(xì)胞。構(gòu)建表達(dá)特異干擾PGI基

4、因siRNA的慢病毒質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒，利用表達(dá)PGI siRNA的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)PGI的白血病細(xì)胞，RT-PCR、Western Blot檢測(cè)該白血病細(xì)胞中PGI的表達(dá)。
　　第二部分
　　利用cck-8檢測(cè)RNA干擾白血病細(xì)胞PGI基因后細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)RNA干擾白血病細(xì)胞PGI基因后細(xì)胞的周期分布和凋亡情況。Elisa檢測(cè)干擾后細(xì)胞外液PGI含量。Western blot檢測(cè)干擾后糖酵解途徑HK2、

5、PGI、LDHA、PKM2的蛋白表達(dá);Western blot檢測(cè)干擾后AMF下游PI3K-Akt途徑PI3K、Akt、cyclinD1、caspase-3的蛋白表達(dá)。
　　第三部分
　　用己糖激酶抑制劑3-BrPA和人參皂苷單體Rh2處理高表達(dá)PGI基因的白血病細(xì)胞，人參皂苷單體Rh2處理干擾后KG1-α細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)糖酵解途徑HK2、PGI、LDHA、PKM2的蛋白表達(dá);Westernblot檢測(cè)AMF

6、下游PI3K-Akt途徑PI3K、Akt、cyclinD1、caspase-3的蛋白表達(dá)，觀察Rh2是否通過(guò)PGI發(fā)揮作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、白血病細(xì)胞中PGI的mRNA和蛋白表達(dá)量明顯高于人單核細(xì)胞，其中以KG1-α細(xì)胞表達(dá)量最高。
　　2、成功構(gòu)建表達(dá)PGI siRNA的慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后能使白血病細(xì)胞系KG1-α的PGI基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平下調(diào)。干擾組PGI mRNA的抑制率為55.4％，

7、與陰性對(duì)照組比較，有明顯差異(P＜0.01);干擾組PGI蛋白的抑制率為83.1％，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3、CCK8檢測(cè)KG1-α細(xì)胞增殖:白血病細(xì)胞在第5天出現(xiàn)增殖高峰。干擾組細(xì)胞增殖能力明顯低于陰性對(duì)照組。(P＜0.01)
　　4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期:干擾組增殖指數(shù)為40.48±0.59％，明顯低于陰性對(duì)照組60.65±0.62％和空白對(duì)照組56.61±0.68％。(P＜0.05

8、)
　　5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:干擾組細(xì)胞凋亡率23.00±0.65％，明顯高于陰性對(duì)照組3.94±0.48％和空白對(duì)照組4.92±0.33％。
　　6、Elisa檢測(cè)干擾后細(xì)胞外液PGI含量明顯降低。
　　7、western blot檢測(cè)干擾PGI后糖酵解途徑及PI3K/Akt途徑受到抑制。
　　8、western blot檢測(cè)Rh2作用后糖酵解途徑及PI3K/Akt途徑均受到抑制。
　　結(jié)論:

9、>　　1、PGI在白血病細(xì)胞中高表達(dá)，其中以KG1-α細(xì)胞表達(dá)量最高。
　　2、成功構(gòu)建了人PGI慢病毒質(zhì)粒并感染人白血病細(xì)胞系KG1-α，發(fā)現(xiàn)能有效抑制KG1-α細(xì)胞PGI基因mRNA和蛋白的表達(dá)。下調(diào)白血病細(xì)胞KG1-α中PGI的表達(dá)能降低細(xì)胞的增殖能力，能影響將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，增加細(xì)胞凋亡。
　　4、下調(diào)PGI基因后能抑制細(xì)胞的糖酵解途徑。
　　5、下調(diào)PGI基因后能抑制細(xì)胞自分泌PGI/AMF，并抑