心肌缺血-再灌注損傷中蛋白磷酸酶PHLPP1的表達(dá)調(diào)控及作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　缺血性心臟?。↖HD）是危害國(guó)人健康的重要疾病，及時(shí)恢復(fù)血流灌注是改善臨床預(yù)后的最有效策略。但再灌注會(huì)加重單純心肌缺血造成的損傷，即心肌再灌注損傷。如何最大限度減輕心肌缺血/再灌注（MI/R）損傷，提高缺血性心肌病救治效果，是心血管領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題。因此，探尋再灌注損傷發(fā)生的分子機(jī)制，將為臨床更好的救治急性心肌梗死提供理論依據(jù)。
　　蛋白磷酸酶PHLPP，是目前發(fā)現(xiàn)的Akt特異性磷酸酶，可使Akt去磷酸

2、化失活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增殖。近年來(lái)的研究表明，該蛋白磷酸酶家族中的一種異構(gòu)體，PHLPP1，在心肌I/R損傷以及衰老心肌缺血易損性中扮演重要角色。然而，心肌I/R本身對(duì)PHLPP1蛋白表達(dá)的影響，及其調(diào)控機(jī)制，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，我們前期的工作證實(shí)，胰島素可通過(guò)泛素蛋白酶體通路促進(jìn) PHLPP1的蛋白降解，強(qiáng)化其心肌保護(hù)作用。研究表明，當(dāng)胰島素通路受損時(shí)，即肥胖伴有胰島素抵抗病人骨骼肌中PHLPP1表達(dá)上調(diào)。提示P

3、HLPP1與胰島素抵抗關(guān)系密切。胰島素抵抗是2型糖尿病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。然而，糖尿病條件下，心肌中PHLPP1的變化及其在糖尿病心肌缺血易損性中的作用，目前仍不清楚。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.明確心肌I/R對(duì)PHLPP1表達(dá)的影響；進(jìn)一步闡明影響心肌PHLPP1表達(dá)的具體分子機(jī)制。
　　2.探討PHLPP1在胰島素抵抗心肌缺血易損性中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.心肌I/R調(diào)節(jié)PHLPP1表達(dá)的機(jī)制研究

4、：采用10~12周齡雄性C57BL/6小鼠，構(gòu)建急性心肌I/R模型，再灌注不同時(shí)間點(diǎn)（30 min，1 h，2 h，3 h，4 h）收集缺血區(qū)心肌組織。取1~3天齡 SD大鼠，培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞，采用離體缺氧/復(fù)氧（H/R）模擬心肌I/R，缺氧4 h，在復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)（1 h，2 h，3 h，4 h）收集心肌細(xì)胞；按照實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)用TNF-α（20 ng/mL），H2O2（150μM）及相應(yīng)抑制劑（依那西普：1μg/mL、NAC：5

5、mM）預(yù)處理心肌細(xì)胞。采用蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光染色方法觀察轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB表達(dá)及其核轉(zhuǎn)位。采用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）方法確定NF-κB與phlpp1基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的相互作用。
　　2.PHLPP1在糖尿病心肌缺血易損性中的作用研究：采用雄性ob/ob小鼠（10~12周齡）和同周齡的野生型C56BL/6小鼠，構(gòu)建急性心肌I/R模型，缺血30 min，再灌注2 h取缺血區(qū)心肌組織檢測(cè)蛋白表達(dá)，

6、再灌注24 h檢測(cè)心肌梗死面積。采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，ELISA方法檢測(cè)血清TNF-α水平。取缺血區(qū)心肌組織制備石蠟切片，采用免疫熒光染色和TUNEL染色方法檢測(cè)蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡。整體水平通過(guò)葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（IPGTT）和胰島素敏感性實(shí)驗(yàn)（IST）確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)胰島素的反應(yīng)性。培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞，采用高糖+胰島素（Glucose：4,500 mg/L；Insulin：100 nM）長(zhǎng)時(shí)間（24 h）預(yù)處理心肌細(xì)胞模

7、擬胰島素抵抗。心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染PHLPP1特異siRNA，隨后進(jìn)行H/R處理，并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH水平。采用JC-1熒光染色方法觀察線粒體膜電位變化情況，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。整體動(dòng)物水平，分離心肌細(xì)胞線粒體，檢測(cè)PHLPP1在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)位變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.I/R及H/R后心肌PHLPP1蛋白水平出現(xiàn)時(shí)程變化。整體動(dòng)物水平，再灌注2 h心肌PHLPP1表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而再灌注4 h P

8、HLPP1蛋白水平明顯降低；原代乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中，復(fù)氧1 h心肌PHLPP1表達(dá)上調(diào)，復(fù)氧4 h時(shí)，PHLPP1蛋白水平明顯減少；
　　2.炎癥和氧化應(yīng)激共同調(diào)節(jié)PHLPP1蛋白表達(dá)。作為再灌注損傷的重要始動(dòng)因素，炎癥反應(yīng)上調(diào)PHLPP1表達(dá)。采用重組TNF-α處理心肌細(xì)胞1 h顯著上調(diào)PHLPP1蛋白水平，與之相比，TNF-α處理4小時(shí)PHLPP1蛋白水平有所減少；用TNF-α抑制劑依那西普（Etanercept）預(yù)

9、處理心肌細(xì)胞，顯著抑制TNF-α作用1 h PHLPP1的蛋白水平。H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)PHLPP1表達(dá)無(wú)明顯影響，但抗氧化劑NAC預(yù)處理心肌細(xì)胞可上調(diào)H2O2刺激4 h心肌PHLPP1蛋白水平。此外，短時(shí)間（1 h）炎癥因子和氧化應(yīng)激共同作用與TNF-α單獨(dú)刺激對(duì)PHLPP1蛋白水平的影響一致，表現(xiàn)為T(mén)NF-α的上調(diào)作用；二者共同作用時(shí)間延長(zhǎng)至4 h，表現(xiàn)為H2O2的抑制作用。TNF-α抑制劑Etanercept預(yù)處理顯著降低復(fù)氧

10、1 h引起的PHLPP1高表達(dá)，而NAC預(yù)處理后PHLPP1的表達(dá)無(wú)明顯改變；另一方面，抗氧化劑NAC預(yù)處理可以上調(diào)復(fù)氧4 h后心肌PHLPP1水平。
　　3.TNF-α活化NF-κB核轉(zhuǎn)位活性介導(dǎo)PHLPP1表達(dá)。TNF-α是激活經(jīng)典N(xiāo)F-κB信號(hào)通路的重要配體。采用PDTC（NF-κB抑制劑）預(yù)處理顯著降低TNF-α處理1小時(shí)引起的PHLPP1表達(dá)上調(diào)；相應(yīng)地，PDTC使缺氧/復(fù)氧后PHLPP1的表達(dá)明顯減少。隨后找到 phl

11、pp1基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)，得到 phlpp1基因啟動(dòng)子區(qū)域可能與轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB發(fā)生相互作用的片段：-83~-92(I)，-884~-893(II)，-1,383~-1,392(III)和-1,465~-1,474(IV)。采用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）方法，確定NF-κB與phlpp1啟動(dòng)子區(qū)域-1,383~-1,392(III)存在蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用，而PDTC預(yù)處理可抑制二者間的結(jié)合。
　　4.

12、Ob/ob小鼠出現(xiàn)明顯的全身胰島素抵抗，并且，與野生型相比，ob/ob小鼠心肌I/R之后心肌梗死面積增加。同時(shí)，蛋白質(zhì)免疫印跡與熒光染色結(jié)果均顯示，ob/ob小鼠心肌PHLPP1本底水平明顯上調(diào)，但心肌I/R之后PHLPP1蛋白表達(dá)減少。與之對(duì)應(yīng)，采用原代乳鼠心肌細(xì)胞模擬胰島素抵抗模型，此時(shí)心肌PHLPP1水平顯著高于正常組。在此基礎(chǔ)上給予H/R處理，PHLPP1表達(dá)出現(xiàn)一定程度的下調(diào)。
　　5.胰島素抵抗時(shí)，TNF-α介導(dǎo)心肌P

13、HLPP1的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠血清中TNF-α水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型，而I/R后TNF-α含量顯著降低。另一方面，模擬胰島素抵抗心肌細(xì)胞中，NF-κB的磷酸化水平以及 TNF-α mRNA水平顯著高于Control組，但H/R后pNF-κB表達(dá)降低，與心肌PHLPP1的表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　6.下調(diào)PHLPP1表達(dá)減輕胰島素抵抗心肌細(xì)胞H/R損傷。采用siRNA下調(diào)PHLPP1蛋白水平，可使胰島素抵抗心肌細(xì)胞本底及缺氧/復(fù)氧后

14、培養(yǎng)基上清中LDH水平明顯減少。流式細(xì)胞術(shù)及Caspase3活化程度檢測(cè)結(jié)果均顯示，下調(diào)PHLPP1表達(dá)可減輕胰島素抵抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。
　　7.下調(diào)PHLPP1表達(dá)增強(qiáng)心肌細(xì)胞線粒體膜電位。線粒體膜電位下降是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路的標(biāo)志性事件之一。采用JC-1熒光探針標(biāo)記，觀察線粒體膜電位變化。我們發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降，H/R后膜電位進(jìn)一步降低。與之對(duì)應(yīng)，采用siRNA抑制PHLPP1蛋白水

15、平使胰島素抵抗心肌細(xì)胞本底及H/R后線粒體膜電位明顯上升。
　　8.I/R增強(qiáng)ob/ob小鼠心肌PHLPP1向線粒體轉(zhuǎn)位。心肌I/R后，野生型小鼠心肌細(xì)胞線粒體中PHLPP1表達(dá)上調(diào)；與之相比，ob/ob小鼠心肌細(xì)胞中PHLPP1向線粒體轉(zhuǎn)位明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1.心肌I/R及H/R過(guò)程中，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激共同參與調(diào)控心肌PHLPP1表達(dá)。一方面，炎癥因子TNF-α活化NF-κB向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)PHLPP1