版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:
缺血性心臟?。↖HD)是危害國(guó)人健康的重要疾病,及時(shí)恢復(fù)血流灌注是改善臨床預(yù)后的最有效策略。但再灌注會(huì)加重單純心肌缺血造成的損傷,即心肌再灌注損傷。如何最大限度減輕心肌缺血/再灌注(MI/R)損傷,提高缺血性心肌病救治效果,是心血管領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題。因此,探尋再灌注損傷發(fā)生的分子機(jī)制,將為臨床更好的救治急性心肌梗死提供理論依據(jù)。
蛋白磷酸酶PHLPP,是目前發(fā)現(xiàn)的Akt特異性磷酸酶,可使Akt去磷酸
2、化失活,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增殖。近年來(lái)的研究表明,該蛋白磷酸酶家族中的一種異構(gòu)體,PHLPP1,在心肌I/R損傷以及衰老心肌缺血易損性中扮演重要角色。然而,心肌I/R本身對(duì)PHLPP1蛋白表達(dá)的影響,及其調(diào)控機(jī)制,目前尚未見(jiàn)報(bào)道。此外,我們前期的工作證實(shí),胰島素可通過(guò)泛素蛋白酶體通路促進(jìn) PHLPP1的蛋白降解,強(qiáng)化其心肌保護(hù)作用。研究表明,當(dāng)胰島素通路受損時(shí),即肥胖伴有胰島素抵抗病人骨骼肌中PHLPP1表達(dá)上調(diào)。提示P
3、HLPP1與胰島素抵抗關(guān)系密切。胰島素抵抗是2型糖尿病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。然而,糖尿病條件下,心肌中PHLPP1的變化及其在糖尿病心肌缺血易損性中的作用,目前仍不清楚。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br> 1.明確心肌I/R對(duì)PHLPP1表達(dá)的影響;進(jìn)一步闡明影響心肌PHLPP1表達(dá)的具體分子機(jī)制。
2.探討PHLPP1在胰島素抵抗心肌缺血易損性中的作用。
實(shí)驗(yàn)方法:
1.心肌I/R調(diào)節(jié)PHLPP1表達(dá)的機(jī)制研究
4、:采用10~12周齡雄性C57BL/6小鼠,構(gòu)建急性心肌I/R模型,再灌注不同時(shí)間點(diǎn)(30 min,1 h,2 h,3 h,4 h)收集缺血區(qū)心肌組織。取1~3天齡 SD大鼠,培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞,采用離體缺氧/復(fù)氧(H/R)模擬心肌I/R,缺氧4 h,在復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)(1 h,2 h,3 h,4 h)收集心肌細(xì)胞;按照實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)用TNF-α(20 ng/mL),H2O2(150μM)及相應(yīng)抑制劑(依那西普:1μg/mL、NAC:5
5、mM)預(yù)處理心肌細(xì)胞。采用蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光染色方法觀察轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB表達(dá)及其核轉(zhuǎn)位。采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法確定NF-κB與phlpp1基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的相互作用。
2.PHLPP1在糖尿病心肌缺血易損性中的作用研究:采用雄性ob/ob小鼠(10~12周齡)和同周齡的野生型C56BL/6小鼠,構(gòu)建急性心肌I/R模型,缺血30 min,再灌注2 h取缺血區(qū)心肌組織檢測(cè)蛋白表達(dá),
6、再灌注24 h檢測(cè)心肌梗死面積。采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平,ELISA方法檢測(cè)血清TNF-α水平。取缺血區(qū)心肌組織制備石蠟切片,采用免疫熒光染色和TUNEL染色方法檢測(cè)蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡。整體水平通過(guò)葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)和胰島素敏感性實(shí)驗(yàn)(IST)確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)胰島素的反應(yīng)性。培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞,采用高糖+胰島素(Glucose:4,500 mg/L;Insulin:100 nM)長(zhǎng)時(shí)間(24 h)預(yù)處理心肌細(xì)胞模
7、擬胰島素抵抗。心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染PHLPP1特異siRNA,隨后進(jìn)行H/R處理,并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH水平。采用JC-1熒光染色方法觀察線粒體膜電位變化情況,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。整體動(dòng)物水平,分離心肌細(xì)胞線粒體,檢測(cè)PHLPP1在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)位變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1.I/R及H/R后心肌PHLPP1蛋白水平出現(xiàn)時(shí)程變化。整體動(dòng)物水平,再灌注2 h心肌PHLPP1表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而再灌注4 h P
8、HLPP1蛋白水平明顯降低;原代乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中,復(fù)氧1 h心肌PHLPP1表達(dá)上調(diào),復(fù)氧4 h時(shí),PHLPP1蛋白水平明顯減少;
2.炎癥和氧化應(yīng)激共同調(diào)節(jié)PHLPP1蛋白表達(dá)。作為再灌注損傷的重要始動(dòng)因素,炎癥反應(yīng)上調(diào)PHLPP1表達(dá)。采用重組TNF-α處理心肌細(xì)胞1 h顯著上調(diào)PHLPP1蛋白水平,與之相比,TNF-α處理4小時(shí)PHLPP1蛋白水平有所減少;用TNF-α抑制劑依那西普(Etanercept)預(yù)
9、處理心肌細(xì)胞,顯著抑制TNF-α作用1 h PHLPP1的蛋白水平。H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)PHLPP1表達(dá)無(wú)明顯影響,但抗氧化劑NAC預(yù)處理心肌細(xì)胞可上調(diào)H2O2刺激4 h心肌PHLPP1蛋白水平。此外,短時(shí)間(1 h)炎癥因子和氧化應(yīng)激共同作用與TNF-α單獨(dú)刺激對(duì)PHLPP1蛋白水平的影響一致,表現(xiàn)為T(mén)NF-α的上調(diào)作用;二者共同作用時(shí)間延長(zhǎng)至4 h,表現(xiàn)為H2O2的抑制作用。TNF-α抑制劑Etanercept預(yù)處理顯著降低復(fù)氧
10、1 h引起的PHLPP1高表達(dá),而NAC預(yù)處理后PHLPP1的表達(dá)無(wú)明顯改變;另一方面,抗氧化劑NAC預(yù)處理可以上調(diào)復(fù)氧4 h后心肌PHLPP1水平。
3.TNF-α活化NF-κB核轉(zhuǎn)位活性介導(dǎo)PHLPP1表達(dá)。TNF-α是激活經(jīng)典N(xiāo)F-κB信號(hào)通路的重要配體。采用PDTC(NF-κB抑制劑)預(yù)處理顯著降低TNF-α處理1小時(shí)引起的PHLPP1表達(dá)上調(diào);相應(yīng)地,PDTC使缺氧/復(fù)氧后PHLPP1的表達(dá)明顯減少。隨后找到 phl
11、pp1基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域,通過(guò)軟件預(yù)測(cè),得到 phlpp1基因啟動(dòng)子區(qū)域可能與轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB發(fā)生相互作用的片段:-83~-92(I),-884~-893(II),-1,383~-1,392(III)和-1,465~-1,474(IV)。采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法,確定NF-κB與phlpp1啟動(dòng)子區(qū)域-1,383~-1,392(III)存在蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用,而PDTC預(yù)處理可抑制二者間的結(jié)合。
4.
12、Ob/ob小鼠出現(xiàn)明顯的全身胰島素抵抗,并且,與野生型相比,ob/ob小鼠心肌I/R之后心肌梗死面積增加。同時(shí),蛋白質(zhì)免疫印跡與熒光染色結(jié)果均顯示,ob/ob小鼠心肌PHLPP1本底水平明顯上調(diào),但心肌I/R之后PHLPP1蛋白表達(dá)減少。與之對(duì)應(yīng),采用原代乳鼠心肌細(xì)胞模擬胰島素抵抗模型,此時(shí)心肌PHLPP1水平顯著高于正常組。在此基礎(chǔ)上給予H/R處理,PHLPP1表達(dá)出現(xiàn)一定程度的下調(diào)。
5.胰島素抵抗時(shí),TNF-α介導(dǎo)心肌P
13、HLPP1的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠血清中TNF-α水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型,而I/R后TNF-α含量顯著降低。另一方面,模擬胰島素抵抗心肌細(xì)胞中,NF-κB的磷酸化水平以及 TNF-α mRNA水平顯著高于Control組,但H/R后pNF-κB表達(dá)降低,與心肌PHLPP1的表達(dá)趨勢(shì)一致。
6.下調(diào)PHLPP1表達(dá)減輕胰島素抵抗心肌細(xì)胞H/R損傷。采用siRNA下調(diào)PHLPP1蛋白水平,可使胰島素抵抗心肌細(xì)胞本底及缺氧/復(fù)氧后
14、培養(yǎng)基上清中LDH水平明顯減少。流式細(xì)胞術(shù)及Caspase3活化程度檢測(cè)結(jié)果均顯示,下調(diào)PHLPP1表達(dá)可減輕胰島素抵抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。
7.下調(diào)PHLPP1表達(dá)增強(qiáng)心肌細(xì)胞線粒體膜電位。線粒體膜電位下降是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路的標(biāo)志性事件之一。采用JC-1熒光探針標(biāo)記,觀察線粒體膜電位變化。我們發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降,H/R后膜電位進(jìn)一步降低。與之對(duì)應(yīng),采用siRNA抑制PHLPP1蛋白水
15、平使胰島素抵抗心肌細(xì)胞本底及H/R后線粒體膜電位明顯上升。
8.I/R增強(qiáng)ob/ob小鼠心肌PHLPP1向線粒體轉(zhuǎn)位。心肌I/R后,野生型小鼠心肌細(xì)胞線粒體中PHLPP1表達(dá)上調(diào);與之相比,ob/ob小鼠心肌細(xì)胞中PHLPP1向線粒體轉(zhuǎn)位明顯增加。
結(jié)論:
1.心肌I/R及H/R過(guò)程中,炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激共同參與調(diào)控心肌PHLPP1表達(dá)。一方面,炎癥因子TNF-α活化NF-κB向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,介導(dǎo)PHLPP1
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 大鼠心肌缺血再灌注損傷中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活性研究.pdf
- 心肌缺血再灌注損傷的分子機(jī)制和基因表達(dá)調(diào)控.pdf
- 鈣調(diào)磷酸酶在老齡大鼠心肌缺血再灌注中調(diào)控P38MAPK信號(hào)通路的機(jī)制研究.pdf
- Urantide對(duì)心肌缺血及再灌注損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制.pdf
- 心肌缺血-再灌注損傷中核受體LXR的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf
- 前凋亡蛋白Bim調(diào)控心肌缺血再灌注損傷中自噬及凋亡的機(jī)制研究.pdf
- NECA保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制研究.pdf
- CARD9在心肌缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf
- 定心方防治心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制研究.pdf
- 甘氨酸對(duì)心肌缺血-再灌注損傷的防治作用及機(jī)制研究.pdf
- 舒絡(luò)粉針劑抗心肌缺血-再灌注損傷及作用機(jī)制研究.pdf
- 蕨麻抗缺氧及心肌缺血-再灌注損傷作用和機(jī)制研究.pdf
- IL-17A在心肌缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf
- 心肌缺血-再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 蘆丁對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf
- TNFAIP8家族在心肌缺血再灌注損傷中的表達(dá)及作用機(jī)制.pdf
- 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)(RIPostC)對(duì)心肌缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究.pdf
- 硫氧還蛋白系統(tǒng)在衰老大鼠心肌缺血-再灌注損傷中的作用.pdf
- 心肌缺血和缺血再灌注損傷
- 磷酸肌酸及缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論