神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中MANF的差異性表達(dá).pdf

1、中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子( Mesencephalic Astrocyte-derived Neurotrophic Factor, MANF),是一種分泌蛋白,約20KD,最初從體外培養(yǎng)的大鼠中腦Ⅰ型星形膠質(zhì)細(xì)胞株中分離出來。它和保守型多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子(Conserved Dopamine Neurotrophic Factor, CDNF)同屬于新生的神經(jīng)營養(yǎng)因子保守家族。最近研究發(fā)現(xiàn),體內(nèi)或體外培養(yǎng)的神經(jīng)元受到損傷刺

2、激時MANF的表達(dá)會升高。然而MANF在不同類型膠質(zhì)細(xì)胞,尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)模式尚未明了。為了深入研究這個問題,檢測了正常大鼠和腦缺血大鼠神經(jīng)元MANF的表達(dá)量。令人驚訝的是,發(fā)現(xiàn)正常大鼠的大腦皮層中,MANF主要由神經(jīng)元分泌,星形膠質(zhì)細(xì)胞僅在嚴(yán)重缺血時表達(dá)MANF,這與它的名稱不符合。然而,在體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,包括星形膠質(zhì)細(xì)胞中可見MANF表達(dá),使用ER應(yīng)激的刺激或營養(yǎng)被剝奪可使MANF表達(dá)上調(diào)。另外,最有趣的是小膠

3、質(zhì)細(xì)胞MANF的表達(dá)模式,皮層和海馬散在的活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)MANF,但輕度缺血導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞聚集時MANF無明顯表達(dá)。這些結(jié)果表明,MANF的表達(dá)是可誘導(dǎo)的,且在不同類型的膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)具有差異性,腦組織中神經(jīng)元是MANF的主要來源。
　　目的:
　　觀察MANF在中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　方法:
　　線栓法制作SD大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型,分別缺血2小時和4小時,再灌注24小時后處死大鼠

4、。原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞取自孕16-18天SD大鼠胚胎,皮層和海馬分開研磨、離心、計數(shù)后重懸培養(yǎng)于含血清的DMEM數(shù)天,之后分別用低血清、MG132和衣霉素處理。RT-PCR方法檢測ER應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平,Western Blotting和免疫熒光檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)分布。用PI染色法鑒別死細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　　1.星形膠質(zhì)細(xì)胞中MANF的表達(dá)
　　用熒光雙標(biāo)法檢測大鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞中MANF的表達(dá), G

5、FAP和NeuN分別是星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白。在正常大鼠大腦皮層,MANF主要在NeuN陽性細(xì)胞表達(dá),而星形膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)。輕度腦缺血時,GFAP陰性細(xì)胞中MANF表達(dá)上調(diào)。然而重度腦缺血可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MANF。5％血清培養(yǎng)的正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中MANF幾乎不表達(dá)。然而ER應(yīng)激時,包括衣霉素、MG132和無血清培養(yǎng),MANF可被誘導(dǎo)表達(dá)。通過RT-PCR和Western Blotting檢測MANF的蛋白和mRNA水平,

6、結(jié)果表明腦組織中神經(jīng)元是MANF的主要來源,星形膠質(zhì)細(xì)胞在ER應(yīng)激刺激下可表達(dá)MANF。
　　2.小膠質(zhì)細(xì)胞中MANF的表達(dá)
　　為了觀察小膠質(zhì)細(xì)胞中MANF的表達(dá)情況,用小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白CD68的單抗和MANF的單抗進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在正常腦組織中有少量CD68陽性的細(xì)胞中有MANF表達(dá),而正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞中沒有檢測到MANF的表達(dá)。另外MANF的表達(dá)與小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)有關(guān),例如桿狀或靜止?fàn)顟B(tài)的網(wǎng)狀小膠質(zhì)

7、細(xì)胞不表達(dá)MANF,阿米巴樣或圓形的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MANF。在缺血的腦組織中,散在的小膠質(zhì)細(xì)胞中MANF免疫反應(yīng)陽性;而皮層和海馬中聚集的小膠質(zhì)細(xì)胞中無MANF表達(dá)。這些結(jié)果表明:MANF在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)不僅依賴于其形態(tài),而且與小膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)有關(guān)。在體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中也檢測到MANF的表達(dá)。5%血清培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞呈桿狀或網(wǎng)狀,幾乎不表達(dá)MANF。衣霉素處理24小時后,小膠質(zhì)細(xì)胞變成阿米巴樣或圓形,此時小膠質(zhì)細(xì)胞中MANF表達(dá)

8、上調(diào)。
　　3. MANF在少突膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)
　　在正常大腦皮層中的少突膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)分枝狀,且胞體很小,CNP分布在放射狀的樹突和軸突。腦缺血時MANF在胞體表達(dá),而樹突和軸突表達(dá)減少。DAPI雙標(biāo)檢測到細(xì)胞核中有少量的MANF。與星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞相同的是衣霉素處理后少突膠質(zhì)細(xì)胞中MANF表達(dá)上調(diào)。這個結(jié)果表明腦缺血和ER應(yīng)激均可誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞中MANF的表達(dá)。
　　4.原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞中MANF的表達(dá)

9、
　　Bip和CHOP是ER應(yīng)激的標(biāo)志物。用衣霉素、MG132和營養(yǎng)剝奪均可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MANF。Bip和CHOP的mRNA和蛋白均被上調(diào),而無血清培養(yǎng)對CHOP蛋白水平作用較小。該結(jié)果提示,膠質(zhì)細(xì)胞可被誘導(dǎo)出現(xiàn)ER應(yīng)激及MANF表達(dá)。同時,PI染色和DAPI染色結(jié)果顯示,衣霉素、MG132處理和無血清培養(yǎng)可引起PI陽性細(xì)胞增加,提示ER應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
　　結(jié)論:
　　以上研究結(jié)果表明,在腦組織