青蒿琥酯對(duì)人腺樣囊性癌順鉑耐藥NACC-DDP細(xì)胞系侵襲趨化及誘導(dǎo)血管形成的影響.pdf

1、目的:
　　誘導(dǎo)獲得耐受順鉑(Cisplatin，DDP)的人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系，研究青蒿琥酯(Artesunate，ART)對(duì)其侵襲能力的影響，ART對(duì)耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)趨化遷移的影響，以及ART對(duì)耐藥腺樣囊性癌裸小鼠腮腺移植瘤血管生成的影響。
　　方法:
　　1.以NACC細(xì)胞系為親本細(xì)胞，采用3μM濃度的DD

2、P，周期性作用的方式，誘導(dǎo)獲得耐DDP的腺樣囊性癌細(xì)胞系;MTT法檢測(cè)耐藥細(xì)胞的耐藥程度，Transwell檢測(cè)DDP干預(yù)下耐藥細(xì)胞與NACC親本細(xì)胞侵襲能力的差別，驗(yàn)證其耐藥性;
　　2.MTT法檢測(cè)ART對(duì)耐藥細(xì)胞增殖的抑制作用，選取后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物的濃度;
　　3.Transwell檢測(cè)ART對(duì)耐藥細(xì)胞侵襲遷移能力的抑制作用;
　　4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ART處理耐藥細(xì)胞后獲得的條件培養(yǎng)基對(duì)HUVEC細(xì)胞移動(dòng)能力的抑制

3、作用;
　　5.Transwell檢測(cè)共培養(yǎng)條件下ART對(duì)耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞趨化遷移過(guò)程的影響;
　　6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同濃度ART干預(yù)耐藥細(xì)胞48 h后，E-cadherin、MMP-9、COX-2、VEGFA mRNA表達(dá)的變化;
　　7.建立裸小鼠腮腺移植瘤模型，免疫組化法檢測(cè)腹腔注射不同濃度ART后，裸小鼠腮腺移植瘤組織中E-cadherin、MMP-9、VEGFA蛋白的表達(dá)水平;
　

4、　8.CD34標(biāo)記瘤組織中的血管并計(jì)數(shù)。
　　9.采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，兩樣本數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本數(shù)據(jù)組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過(guò)7個(gè)月的誘導(dǎo)過(guò)程，初步建立了具有穩(wěn)定耐藥性的耐藥腺樣囊性癌細(xì)胞系，命名為NACC/DDP，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察間NAC

5、C/DDP細(xì)胞體積增大，核仁數(shù)目增多，形態(tài)不規(guī)則。
　　2.MTT結(jié)果顯示NACC/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥指數(shù)為2.16，Transwell結(jié)果顯示在1.5μM DDP干預(yù)下，NACC/DDP細(xì)胞侵襲遷移的細(xì)胞數(shù)目比NACC細(xì)胞多(P＜0.05)。
　　3.MTT結(jié)果顯示ART能有效抑制NACC/DDP細(xì)胞的增殖，隨藥物濃度增加，NACC/DDP細(xì)胞增殖所受到的抑制更明顯，經(jīng)計(jì)算并分析，ART對(duì)NACC/DDP細(xì)胞的半數(shù)致

6、死濃度(IC50)為1258.52±36.87μM，IC05為166.86±49.84μM，為減少ART抑殺NACC/DDP細(xì)胞的作用對(duì)侵襲遷移實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)選取37.5、75、150、600μM為實(shí)驗(yàn)濃度。
　　4.Transwell結(jié)果顯示ART對(duì)NACC/DDP細(xì)胞的侵襲遷移能力有抑制作用，隨著濃度的增加，抑制作用越加明顯(P＜0.05)。
　　5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示ART干預(yù)NACC/DDP后的條件培養(yǎng)基能夠抑制

7、HUVEC細(xì)胞的移動(dòng)能力，ART濃度越高，所制得的條件培養(yǎng)基對(duì)HUVEC細(xì)胞移動(dòng)能力的抑制越明顯（P＜0.05）。在NACC/DDP細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，NACC/DDP細(xì)胞誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞趨化遷移的能力也隨著ART濃度的增加而受到不同程度的抑制(P＜0.05)。
　　6.RT-qPCR結(jié)果顯示:ART在體外能有效抑制NACC/DDP細(xì)胞中MMP-9、VEFGA、COX-2 mRNA的表達(dá)，而NACC/DDP細(xì)胞中E

8、-cadherinmRNA表達(dá)則在ART干預(yù)后呈上調(diào)趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　7.NACC/DDP裸小鼠腮腺移植瘤組織中MMP-9、VEFGA蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率隨ART濃度的升高而降低，E-cadherin蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率隨ART濃度的升高而升高。應(yīng)用CD34標(biāo)記裸小鼠腮腺移植瘤組織中的微血管并計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示ART腹腔注射后，瘤體內(nèi)新生血管數(shù)目較生理鹽水組有所減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論: