白介素-7剪接變異體的克隆及其表達(dá).pdf

1、白細(xì)胞介素-7是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)因子，主要功能是促進(jìn)B細(xì)胞和T細(xì)胞生長(zhǎng)及抗凋亡作用，目前正在探討利用IL-7對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行治療；白細(xì)胞介素-7剪接變異體來源于IL-7基因，但其蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與IL-7有差異，其功能可能參與IL-7功能調(diào)節(jié)；目前對(duì)其功能的研究才剛剛起步。本文將從肝癌細(xì)胞株HepG2、結(jié)腸癌細(xì)胞株 HT29中克隆得到 IL-7及其剪接變異體cDNA，利用原核表達(dá)載體pET-21b表達(dá)IL-7及其在開放閱讀框架內(nèi)的剪接變異

2、體，并鑒定這些剪接變異體蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步研究IL-7剪接變異體的生物活性奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.白細(xì)胞介素-7(IL-7)及其剪接變異體cDNA的獲取和克?。河肨rizol試劑分別從肝癌細(xì)胞株HepG2、結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29中提取總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增出白細(xì)胞介素-7(IL-7)及其剪接變異體的cDNA，將目的片段分別克隆進(jìn)TA載體中，進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定。
　　2.構(gòu)

3、建重組IL-7與在其開放閱讀框架內(nèi)剪接變異體的表達(dá)載體：將IL-7及其開放閱讀框架內(nèi)的剪接變異體如缺乏第4外顯子(IL-7delta4)、缺乏第3、4外顯子(IL-7delta3/4)、缺乏第4和5外顯子(IL-7delta4/5)、缺乏第3、4和第5外顯子(IL-7delta3/4/5)克隆進(jìn)表達(dá)載體中，進(jìn)行PCR、測(cè)序鑒定。
　　3. IL-7及其剪接變異體的原核表達(dá)與鑒定：將上一步所得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中

4、，PCR鑒定后，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。采用SDS-PAGE、Western Blot方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析。
　　4. IL-7及其剪接變異體蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析：運(yùn)用網(wǎng)上的分析軟件對(duì)IL-7與在其開放閱讀框架內(nèi)剪接變異體的蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)進(jìn)行分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.白細(xì)胞介素-7(IL-7)及其剪接變異體基因的克隆：以肝癌細(xì)胞株 HepG2、結(jié)腸癌細(xì)胞株 HT29中提取的總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增所得片段

5、全部克隆進(jìn)入TA載體中，經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明：所獲得的IL-7的基因序列與 GenBank公布的序列完全一致；得到在 IL-7開放閱讀框架內(nèi)的基因有399 bp的缺乏第4外顯子(IL-7delta4)、318 bp的缺乏第3、4外顯子(IL-7delta3/4)、345 bp的缺乏第4和5外顯子(IL-7delta4/5)、264 bp的缺乏第3、4和第5外顯子(IL-7delta3/4/5)；不在IL-7開放閱讀框架內(nèi)剪接變異

6、體有343bp的缺乏第2、4外顯子(IL-7delta2/4)、268 bp的缺乏第2、3、4外顯子(IL-7delta2/3/4)、181 bp的缺乏第2、3、5外顯子(IL-7delta2/3/5)、289 bp的缺乏第2、4、5外顯子(IL-7delta2/4/5)、208 bp的缺乏第2、3、4、5外顯子(IL-7delta2/3/4/5)。
　　2.構(gòu)建重組IL-7及其剪接變異體的原核表達(dá)載體：將IL-7及其剪接變異體亞

7、克隆入原核表達(dá)載體 pET21b中，經(jīng) PCR、測(cè)序鑒定后，成功構(gòu)建 pET21b-IL-7、pET21b-IL-7delta4、pET21b-IL-7delta3/4、pET21b-delta4/5、pET21b-IL-7delta3/4/5表達(dá)質(zhì)粒。
　　3. IL-7及其剪接變異體的原核表達(dá)與鑒定：將pET21b-IL-7、pET21b-IL-7delta4、pET21b-IL-7delta3/4、pET21b-delta4

8、/5、pET21b-IL-7delta3/4/5表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)蛋白的大腸桿菌BL21后，用IPTG來誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE、Western Blot分析為目的蛋白。
　　4. IL-7及其剪接變異體蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析：預(yù)測(cè)得到IL-7及其剪接變異體蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)論：
　　本研究分別從肝癌細(xì)胞株HepG2、結(jié)腸癌細(xì)胞株 HT29中提取總 RNA，進(jìn)行RT-PCR,獲得

9、與GenBank公布序列完全一致的IL-7序列和一系列IL-7剪接變異體。經(jīng)測(cè)序鑒定得到IL-7及4個(gè)在IL-7開放閱讀框架內(nèi)的剪接變異體。將其亞克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET21b，成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET21b-IL-7、pET21b-IL-7delta4、pET21b-IL-7delta3/4、pET21b-IL-7delta4/5、pET21b-IL-7delta3/4/5，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21后，用IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)