缺第4外顯子的IL-7剪接變異體蛋白的活性研究.pdf

1、白細(xì)胞介素7（interleukin-7,IL-7)的全長(zhǎng)基因全長(zhǎng)包含6個(gè)外顯子(531bp），當(dāng)受某些因素影響導(dǎo)致其中的一個(gè)或幾個(gè)外顯子被跳過(guò)，便形成了許多長(zhǎng)短不一的、來(lái)源相同基因的mRNA，從而產(chǎn)生新的不同 IL-7剪接變異體蛋白。IL-7δ4是IL-7缺第4外顯子的剪接變異體，其一級(jí)結(jié)構(gòu)與IL-7有差異，其功能可能參與IL-7功能調(diào)節(jié)，甚至獲得新功能或與 IL-7功能相拮抗。正常人體內(nèi)多個(gè)器官都能檢測(cè)到 IL-7δ4 mRNA，但

2、其生物功能尚未清楚。此外，在多個(gè)腫瘤細(xì)胞株、多發(fā)性硬化癥病人中其mRNA水平異常增高，IL-7δ4是否參與了相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展亦有待研究。
　　目的：
　　本文將利用原核表達(dá)載體pET-21b表達(dá)IL-7δ4，經(jīng)復(fù)性、純化及Westren-blot鑒定，獲得具有生物活性的IL-7δ4蛋白，并對(duì)其活性功能進(jìn)行研究,這對(duì)其正常生理功能的探討、相關(guān)疾病的及時(shí)診治都具有十分重要意義。
　　方法：
　　1. rhIL-7δ

3、4蛋白的制備：利用本室保存的18-T-IL-7δ4為模板進(jìn)行亞克隆，構(gòu)建rhIL-7δ4原核表達(dá)載體pET-21b-IL-7δ4，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析，并優(yōu)化表達(dá)條件。rhIL-7δ4蛋白以包涵體形式表達(dá)，采用梯度透析法進(jìn)行復(fù)性，并經(jīng)過(guò)親和層析色譜法純化。最后，分別以6×His小鼠單克隆抗體和鼠抗人IL-7抗體為一抗，對(duì)純化后rhIL-7δ4蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定。
　　2. rhIL-7δ4蛋白對(duì)正常人外周

4、血單核細(xì)胞的作用：BCA法測(cè)定其濃度后，以rhIIL-7為陽(yáng)性對(duì)照研究rhIIL-7δ4的活性，采用Western-bolt法檢測(cè)其對(duì)外周血單核細(xì)胞凋亡蛋白 BCL-2表達(dá)，以及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析其對(duì)人外周血單核細(xì)胞凋亡的影響。
　　3. rhIL-7δ4蛋白對(duì)肺成纖維細(xì)胞 MCR-5的影響：以 TGF-β1、rhIL-7、rhIL-7δ4干預(yù)MCR-5細(xì)胞，MTT法檢測(cè)其增殖率，以及Western-blot法檢測(cè)collagen

5、 I、α-SMA蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. rhIL-7δ4蛋白的原核表達(dá)、復(fù)性及純化：成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-21b-IL-7δ4。PCR可擴(kuò)增出約399bp的目的片段，與預(yù)期的一致，且測(cè)序結(jié)果與GenBank中IL-7δ4基因序列比較，彼此完全吻合。通過(guò)稀釋與梯度透析過(guò)程，rhIL-7δ4蛋白的復(fù)性效率可達(dá)65％，純化后其純度均達(dá)到了95%以上，且純化樣品經(jīng)Western Blot證實(shí)為rhIL-7δ4。

6、
　　2. rhIL-7δ4蛋白對(duì)正常人PBMCs的作用：在體外，rhIL-7δ4能明顯提高PBMC的BCL-2蛋白表達(dá)，抑制PBMCs的凋亡（P<0.01），與rhIL-7作用是一致的。
　　3. rhIL-7δ4蛋白對(duì)MCR-5細(xì)胞的作用：當(dāng)TGF-β1、rhIL-7、rhIL-7δ4分別作用于體外培養(yǎng)的MRC-5細(xì)胞，都促進(jìn)細(xì)胞增殖（P<0.01），但作用強(qiáng)度有差異（TGF-β1>rhIL-7δ4>rhIL-7），且都

7、能誘導(dǎo)細(xì)胞collagen I、α-SMA蛋白表達(dá)增加（P<0.05)。當(dāng)TGF-β1分別與rhIL-7及rhIL-7δ4合用時(shí)，上述的蛋白表達(dá)增加效應(yīng)更明顯，而預(yù)先用以IL-7R抗體處理MRC-5細(xì)胞，則能逆轉(zhuǎn)rhIL-7及rhIL-7δ4的蛋白表達(dá)誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)rhIL-7δ4蛋白，優(yōu)化其表達(dá)條件，經(jīng)過(guò)復(fù)性和純化，成功獲得高純度的rhIL-7δ4蛋白。在體外，rhIL-7δ4能明顯