前列腺特異膜抗原新剪接變異體PSM-F的發(fā)現(xiàn)與真核表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、研究背景與目的 前列腺特異膜抗原(PSMA)是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于前列腺上皮細(xì)胞，具有較高的前列腺特異性和膜結(jié)合特性，是近年前列腺癌研究的熱點(diǎn)之一。PSMA在正常前列腺中低表達(dá)，在大多數(shù)前列腺癌組織中高表達(dá)，并隨腫瘤的進(jìn)展而表達(dá)增高，在轉(zhuǎn)移癌及激素不敏感型前列腺癌中表達(dá)進(jìn)一步增高，提示PSMA可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，是目前公認(rèn)的前列腺癌診斷及治療靶標(biāo)之一。 PSMA存在多種剪接變異現(xiàn)象，目前發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的PSM

2、A剪接變異體己有四個(gè)。諸多研究提示，PSMA的選擇剪接與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。深入該領(lǐng)域的研究有利于揭示前列腺癌的發(fā)牛機(jī)制，對(duì)尋求更加特異有效的前列腺癌診治靶標(biāo)具有重要意義。 既往有關(guān)PSMA剪接變異的研究多聚焦于對(duì)某單一變異體的表達(dá)鑒定及臨床意義的闡述。由于缺乏系統(tǒng)有效的研究方法和手段，對(duì)其剪接機(jī)制多樣性的認(rèn)識(shí)存在一定的片面性。為了從整體上了解PSMA的剪接變異現(xiàn)象，本研究擬建立以RACE技術(shù)為基礎(chǔ)的有關(guān)PSMA剪接變異

3、體多樣性的分析方法，旨在最大程度地發(fā)現(xiàn)可能存在的PSMA剪接變異體，并對(duì)新發(fā)現(xiàn)變異體進(jìn)行鑒定證實(shí)。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建其真核表達(dá)載體，為后續(xù)的相關(guān)研究墊定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料與方法 1.在PSMA各變異體的相對(duì)公共區(qū)序列設(shè)計(jì)錨定引物，應(yīng)用RACE技術(shù)在LNcap細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。 2.RACE產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行測(cè)定序列的拼接、比對(duì)分析。選取拼接序列的來源RACE片段作為模板，采用重疊PCR進(jìn)行完整序列的重構(gòu)。

4、 3.設(shè)計(jì)重構(gòu)序列的特異性引物，在LNcap細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其天然表達(dá)。 4.應(yīng)用ORFfinder程序查找此序列的開放讀碼框架，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增完整ORF序列，并克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.0。 結(jié)果與討論 應(yīng)用RACE技術(shù)在LNcap細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件拼接分析及重疊PCR重構(gòu)，我們得到一條不同于以往PSMA各變異體序列的完整新序列。經(jīng)證實(shí)該序列在LNcap細(xì)胞天然表達(dá)，確認(rèn)為

5、一種新的PSMA變異體(Genebank號(hào)：EF488812)。盡管該新變異體的臨床及生物學(xué)意義尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)，但它的發(fā)現(xiàn)無疑證實(shí)和豐富了PSMA剪接變異的多樣性，為深入研究前列腺癌的發(fā)生機(jī)制，尋求有效的診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)拓展了思路，提供了新的線索。 在上述研究的基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了PSM-F的真核表達(dá)載體pcDNA3.0／PSM-F。新構(gòu)建的重組子經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)，目的基因與模板序列100％同源，且插入方向及讀碼框架準(zhǔn)確無誤

6、，表明PSM-F真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。此為PSM-F在真核細(xì)胞中的表達(dá)及后續(xù)相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)。 然而，有關(guān)PSMA變異體研究的一個(gè)重要方向及內(nèi)容就是闡明它的臨床及生物學(xué)意義，以確定其臨床及研究中的理論價(jià)值與應(yīng)用前景。而這些又有賴于對(duì)其在不同組織來源細(xì)胞及不同病理改變前列腺組織中表達(dá)差異和生物學(xué)功能的了解，以及對(duì)不同PSMA變異體之間相互作用及關(guān)系的認(rèn)識(shí)。有關(guān)工作本實(shí)驗(yàn)組正加緊研究，相關(guān)結(jié)果將另文報(bào)道。關(guān)于PSMA的選擇性剪接機(jī)