產(chǎn)OXA-48型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌和和大腸埃希菌的研究.pdf

1、目的：
　　篩查碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥或敏感性下降的腸桿菌科的細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行有關(guān)耐藥基因的檢測(cè)；了解近幾年產(chǎn)OXA-48腸桿菌科細(xì)菌在溫州地區(qū)的分布情況；分析blaOXA-48基因在菌株間的轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)2013年1月至2016年12月間分離于我院的碳青霉烯類(lèi)抗生素（美羅培南、亞胺培南或厄他培南）耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)。
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2、.攜帶blaOXA-48菌株的檢測(cè)：通過(guò)PCR擴(kuò)增并測(cè)序篩查菌株中blaOXA-48基因，確定攜帶blaOXA-48菌株。
　　3.攜帶blaOXA-48菌株表型確證試驗(yàn)：通過(guò)改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)是否存在碳青霉烯酶；
　　4.其他β-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)：通過(guò) PCR擴(kuò)增和 DNA測(cè)序?qū)ι鲜鰯y帶blaOXA-48的菌株進(jìn)行其他碳青霉烯酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺(ESBLs)酶及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶基因的檢測(cè)。
　　5.耐藥基因

3、水平轉(zhuǎn)移研究：通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和PCR擴(kuò)增分析，驗(yàn)證blaOXA-48基因是否位于質(zhì)粒上，是否為可接合轉(zhuǎn)移。挑選來(lái)自肺炎克雷伯菌Kp38_wz和大腸埃希菌Ec4676_wz接合子的質(zhì)粒（分別命名為pOXA48_wz和pOXA48_wz1）進(jìn)行質(zhì)粒全基因組測(cè)序。
　　6.攜帶blaOXA-48菌株的分子特征研究：運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型(MLST)分析blaOXA-48陽(yáng)性菌株的序列型；運(yùn)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析攜帶blaOXA

4、-48菌株在同種菌種中是否為同一克隆型的傳播。
　　結(jié)果：
　　1.菌株篩選和藥敏結(jié)果：從245株碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥或敏感性下降的腸桿菌科菌株中分離到2株肺炎克雷伯菌和3株大腸埃希菌攜帶blaOXA-48，且這些菌株都來(lái)自同一病人，該病人從意大利一家醫(yī)院接受外科手術(shù)后回到溫州。這些細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素呈中介或耐藥水平，對(duì)三代頭孢他啶、四代頭孢菌素（頭孢吡肟）、氨曲南和其他抗菌藥物如阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星

5、、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明敏感。
　　2.碳青霉烯酶表型檢測(cè)：2株肺炎克雷伯菌和3株大腸埃希菌改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性。
　　3.耐藥基因檢測(cè)：經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序，2株肺炎克雷伯菌和3株大腸埃希菌除blaOXA-48基因陽(yáng)性外，未檢測(cè)其他碳青霉烯酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺(ESBLs)酶及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶基因。
　　4. MLST分型和PFGE分析：經(jīng)PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序，并與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)2株肺炎

6、克雷伯菌均為ST37，3株大腸埃希菌均為ST69。PFGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)2株肺炎克雷伯菌為同一克隆型，3株大腸埃希菌也為同一克隆型。
　　5.接合和轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：2株肺炎克雷伯菌和3株大腸埃希菌的攜帶blaOXA-48耐藥質(zhì)粒均能通過(guò)接合試驗(yàn)成功地轉(zhuǎn)移至受體菌大腸埃希菌EC600中。同時(shí)將2株肺炎克雷伯菌和3株大腸埃希菌的攜帶blaOXA-48的耐藥質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)轉(zhuǎn)移至大腸埃希菌 DH-5α中。挑選來(lái)自于肺炎克雷伯菌 Kp38_wz和大腸

7、埃希菌Ec4676_wz接合子的質(zhì)粒（分別命名為pOXA48_wz和pOXA48_wz1）進(jìn)行質(zhì)粒全基因組測(cè)序。
　　6.質(zhì)粒序列分析：Kp38_wz攜帶3種耐藥基因，即blaOXA-48、blaSHV-11和dfrA14，而Ec4676_wz中只有一種耐藥基因blaOXA-48。pOXA48_wz和pOXA48_wz1均屬于IncL/M型質(zhì)粒，并且?guī)缀跬耆嗤蓚€(gè)質(zhì)粒的唯一區(qū)別是pOXA48_wz1在nt19099處缺少一個(gè)鳥(niǎo)

8、嘌呤G。pOXA48_wz和pOXA48_wz1與其他攜帶blaoxa-48的IncL/M型質(zhì)粒同源性較高，如pOXA-48a和pKPoxa-48N1。
　　結(jié)論：
　　1.首次在溫州地區(qū)發(fā)現(xiàn)blaOXA-48基因，該基因位于可接合轉(zhuǎn)移的IncL/M型質(zhì)粒上。
　　2.在同一患者中同時(shí)分離出攜帶blaOXA-48的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，可能是blaOXA-48基因在患者體內(nèi)兩種菌之間發(fā)生轉(zhuǎn)移。
　　3.攜帶b