產KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌檢測方法構建與耐藥探索.pdf

1、背景：
　　碳青霉烯類抗生素被認為是治療產超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum p-lactamases, ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC酶)革蘭陰性菌引起的重癥多藥耐藥感染的首選藥物。但隨著該類藥物的廣泛使用，細菌對其耐藥性也日益增加，可以用來有效治療由碳青霉烯類抗生素耐藥菌所致感染的抗生素極其有限，因此這類細菌所致的感染巳成為全球抗感染的重大問題。
　　細菌對碳青霉烯類抗生素產生耐藥性的主要機制有A

2、mpC酶或/和ESBLs高表達合并因外膜孔蛋白(outermembrane proteins, OMP)改變而導致的外膜通透性下降致碳青霉烯類抗生素作用靶位改變而對該類藥物親和力的下降，作用靶位主要為青霉素結合蛋白(penicilHnbinding proteins，PBPs)。水解碳青霉烯類抗生素的β-內酰胺酶(碳青霉烯酶)的產生外排系通改變導致藥物外排的增加，其中產生碳青霉烯酶是鮑曼不動桿菌和腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素產生耐藥性

3、的最主要機制，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素產生耐藥性的機制比較復雜，通常是綜合作用的結果。碳青霉烯酶主要類型有Ambler分子分類中的A、B和D類酶。A類酶常見于腸桿菌科細菌中，近年也在鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌中被報道；B類酶多見于銅綠假單胞菌和不動桿菌中，也可在腸桿菌科細菌中出現(xiàn)；D類酶常見于不動桿菌和銅綠假單胞菌。
　　肺炎克雷白桿菌型碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KP

4、C)是近年被報道最多的A類碳青霉烯酶，2001年首次在美國的一株肺炎克雷伯菌中被分離到。迄今已在全球27個國家和地區(qū)的13種細菌中發(fā)現(xiàn)了16種亞型的KPC酶，其中美國、哥倫比亞、以色列、中國、希臘、巴西、阿根廷、波蘭和意大利為重度流行國家。腸桿菌科細菌是產KPC酶的主要細菌，主要的流行亞型為KPC-2和KPC-3，在我國絕大多數(shù)為KPC-2。在很短的幾年內就在如此多的國家發(fā)現(xiàn)產KPC酶的細菌，甚至有十個國家和地區(qū)在同一年發(fā)現(xiàn)產KPC酶的

5、細菌。而且很多國家首次發(fā)現(xiàn)的攜帶產KPC酶細菌的患者都無進出KPC酶流行地區(qū)的旅游史，也無和來自KPC酶流行地區(qū)人員的接觸史。在美國、加拿大、哥倫比亞、阿根廷、巴西、意大利和波蘭等國家最早被發(fā)現(xiàn)的攜帶產KPC酶細菌的患者均無出國史，在西班牙8名最早被發(fā)現(xiàn)攜帶KPC酶的患者無一例有出國史。在我國分離到產KPC酶細菌的患者大多也無和來自KPC酶流行區(qū)的人員的接觸史。
　　有報道顯示該產 KPC酶菌在院內感染和社區(qū)感染的病原菌方面占有重

6、要比重，在人體中主要存在于呼吸道、泌尿生殖道以及腸道部位，可引起相應人體部位的感染，如呼吸道感染、泌尿道感染、腦膜炎、腸炎和近期所報道的化膿性肝膿腫等疾病。碳青霉烯類抗生素屬于β-內酰胺類抗生素，因其具有較廣的抗菌譜和較強的抗菌活性在臨床上被廣泛使用，研究表明在腸桿菌科細菌中肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥陽性檢出率是最高的。KPC酶被發(fā)現(xiàn)存在于腸桿菌科的多個菌屬當中，肺炎克雷伯菌致病的主要原因是因為產KPC酶。目前要檢測出產KPC

7、型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌難度較大，當采用臨床常規(guī)的藥敏檢測方法進行檢測時常有漏檢發(fā)生，從而導致其在醫(yī)院內的感染情況加劇，因此要治療該菌感染、抑制其傳播的前提是能夠做到正確、有效、及時地檢測出產KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌。為此本研究對產KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的檢測方法及耐藥機制進行了探討。
　　目的：
　　探討產肺炎克雷伯型碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)

8、肺炎克雷伯菌檢測方法以及肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制、可能的治療藥物。
　　方法：
　　選取2014年1月～2014年12月安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院南區(qū)感染辦收集、K-B法證實的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌36株納入本研究，使用改良Hodge試驗、Carba NP試驗對菌株進行驗證，隨后采用PCR擴增、產物瓊脂糖凝膠電泳實驗，并對電泳陽性條帶進行基因測序鑒定。
　　結果：
　　1. K-B法藥敏試驗發(fā)現(xiàn)36

9、株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，對碳青霉烯類耐藥而對替加環(huán)素及米諾環(huán)素仍然敏感；
　　2.36株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌行改良Hodge確證試驗有33株為陽性結果。
　　3.對Hodge試驗陽性33株肺炎克雷伯菌再行Carba NP試驗確證，其中27株陽性（87.9％，27/33），6株（12.1%，6/33）陰性；對Hodge試驗陽性33株肺炎克雷伯菌行PCR擴增及電泳實驗，共有27株出現(xiàn)目標條帶(340bp)提示陽性，與Ca

10、rba NP試驗結果相一致；
　　4.對出現(xiàn)目標條帶的27株肺炎克雷伯菌再進行KPC耐藥基因PCR擴增產物測序，均為KPC-2型耐藥基因。
　　結論：
　　1.初步建立產KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌檢測方法，即K-B法進行藥敏試驗篩選，聯(lián)合Carba NP試驗確證，最后PCR測序證實產KPC類型。
　　2. K-B法藥敏試驗及改良Hodge試驗均存在一定假陽性，存在可靠性問題，Carba NP試驗可靠，PCR測