昆蟲幾丁質(zhì)脫乙?；窧mCDA1的生化表征.pdf

1、幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-葡萄糖胺通過β-1,4糖苷鍵連接的高聚多糖，是構(gòu)成昆蟲表皮的主要成分。幾丁質(zhì)脫乙?；?（CDA1）能夠催化幾丁質(zhì)產(chǎn)生氨基和乙酸，對(duì)昆蟲的表皮的幾丁質(zhì)進(jìn)行修飾，是潛在的農(nóng)藥靶標(biāo)。雖然人們通過 RNA干擾確定了 CDA1的功能缺失會(huì)導(dǎo)致昆蟲蛻皮不正常而死亡，但對(duì)其生化性質(zhì)卻知之甚少。課題組前期重組表達(dá)了全長(zhǎng)家蠶CDA1和CDA7蛋白。本論文工作主要包括重組表達(dá)家蠶幾丁質(zhì)脫乙?；?的催化域（BmCDA1-CAD），

2、對(duì)其進(jìn)行結(jié)晶條件篩選，并研究了全長(zhǎng)BmCDA1和催化域的底物結(jié)合活性及催化活性。另外，也探索了利用大腸桿菌制備亞洲玉米螟CDA1（OfCDA1）雙鏈RNA的方法。
　　本論文研究工作主要包括：
　?。?）構(gòu)建了表達(dá)載體pPIC9-BmCDA1-CAD，在畢赤酵母中得到了BmCDA1-CAD的重組表達(dá)，產(chǎn)量為5 mg/L。發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨富集后，采用金屬螯合層析分離純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western Blot驗(yàn)證得到電

3、泳純的目的蛋白，其實(shí)際分子量約為50 kD。
　?。?）利用Hampton Research公司的晶體試劑盒進(jìn)行了BmCDA1-CAD的結(jié)晶條件篩選。蛋白質(zhì)的緩沖液為20 mM Bis-Tris，10 mM NaCl，pH7.0。初步篩選400個(gè)條件得到晶體能夠生長(zhǎng)的條件，即0.2 M硫酸銨，0.1 M BIS-TRIS pH6.5，25%w/v聚乙二醇3350。之后通過調(diào)整蛋白濃度，pH值及沉淀劑濃度優(yōu)化了363個(gè)結(jié)晶條件，最終

4、確定適于BmCDA1-CAD晶體的生長(zhǎng)條件為：蛋白濃度為12 mg/ml，結(jié)晶緩沖液為0.2 M硫酸銨，0.1 M BIS-TRIS pH6.8，27%w/v聚乙二醇3350。
　?。?）通過對(duì)比陰性對(duì)照BSA發(fā)現(xiàn)，對(duì)于α-幾丁質(zhì)底物，全長(zhǎng)BmCDA1的特異性結(jié)合能力（40%）強(qiáng)于BmCDA1-CAD（33%）；對(duì)于β-幾丁質(zhì)底物，全長(zhǎng)BmCDA1的特異性結(jié)合能力（53%）強(qiáng)于BmCDA1-CAD（32%）；對(duì)于膠體幾丁質(zhì)底物，全

5、長(zhǎng)BmCDA1（27%）有特異性結(jié)合，但是 BmCDA1-CAD（17%）沒有特異性結(jié)合；對(duì)于殼聚糖底物，全長(zhǎng)BmCDA1（16%）和BmCDA1-CAD（12%）都沒有特異性結(jié)合。
　?。?）課題組前期工作證明了利用熒光胺法、MBTH法和對(duì)硝基乙酰苯胺法（基于檢測(cè)游離氨基的生成）無法檢測(cè)到BmCDA7和全長(zhǎng)BmCDA1的催化活性。因此，建立一種新的基于游離乙酸檢測(cè)的方法。以65%乙?；瘹ぞ厶菫榈孜铮訡lCDA為陽(yáng)性對(duì)照，利用微

6、量乙酸檢測(cè)試劑盒，成功檢測(cè)到BmCDA7的脫乙?；钚?，但是全長(zhǎng)BmCDA1和催化域未檢測(cè)到催化活性。序列分析發(fā)現(xiàn)BmCDA7和BmCDA1-CAD的相似性為36%，均有催化所必須的氨基酸。同源建模發(fā)現(xiàn)BmCDA1-CAD有一個(gè)較長(zhǎng)柔性LOOP掩蓋催化口袋，推測(cè)此結(jié)構(gòu)導(dǎo)致催化活性差異。因此將 BmCDA1-CAD的長(zhǎng) LOOP替換為BmCDA7的短LOOP。構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9-BmCAD1/7，并將其電轉(zhuǎn)獲得重組表達(dá)菌株。通過Wes

7、tern Blot驗(yàn)證，目的蛋白BmCAD1/7得到了誘導(dǎo)表達(dá)。需要進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵和分離條件，得到純蛋白以探究LOOP結(jié)構(gòu)對(duì)催化活性的影響。
　?。?）構(gòu)建dsRNA的表達(dá)載體L4440-OfCDA1，L4440-OfEcR，L4440-GFP，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HT115中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，產(chǎn)量分別為3 g/L，0.15 g/L和0.12 g/L。研究結(jié)果表明使用IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生dsRNA的最佳菌液濃度為OD600=0.3；dsRN