美國(guó)白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶5(HcCDA5)基因的分離鑒定與功能初探.pdf

1、美國(guó)白蛾(Hyphantria cunea(Drury))，屬鱗翅目燈蛾科(Arctiidae)，是一種世界性害蟲。幾丁質(zhì)脫乙酰酶(chitin deacetylase，CDA)能夠?qū)锥≠|(zhì)轉(zhuǎn)化為脫乙酰幾丁質(zhì)是昆蟲圍食膜的重要組成成分，是昆蟲幾丁質(zhì)代謝中的一種關(guān)鍵酶。
　　本研究成功擴(kuò)增得到hccda5基因的cDNA序列，序列長(zhǎng)1220bp（GenBank登錄號(hào):KP159288），包含1155bp的ORF和富含AT的UTR。該基

2、因編碼美國(guó)白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶HcCDA5，該蛋白由384個(gè)氨基酸殘基組成，氨基端含有由23個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的信號(hào)肽序列，于Asn22處有一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，于Ser54處有一個(gè)O-聯(lián)糖基化位點(diǎn);HcCDA5只含有幾丁質(zhì)脫乙酰酶催化區(qū)，屬Group V CDA。
　　hccda5基因在大腸桿菌細(xì)胞BL21中成功表達(dá)大小約45kDa的重組蛋白。通過分析載體、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)溫度對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響，確定了目的蛋白最大量

3、表達(dá)條件:即以pET28a-hccda5為重組質(zhì)粒載體，16℃誘導(dǎo)過夜，重組蛋白HcCDA5表達(dá)量較大。hccda5基因在昆蟲細(xì)胞BTI-Tn-5B1-4（HighFive）中成功表達(dá)大小約42kDa的目的蛋白，該蛋白表現(xiàn)出較強(qiáng)的幾丁質(zhì)結(jié)合活性。
　　熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)hccda5基因在美國(guó)白蛾幼蟲不同組織轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果表明，hccda5基因在中腸中表達(dá)量最高，在其他組織中也有少量表達(dá)，在體壁中表

4、達(dá)量最低。
　　qRT-PCR方法分析Cry1Ab35蛋白對(duì)hccda5基因表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)Cry1 Ab35蛋白作用于美國(guó)白蛾幼蟲后hccda5基因表達(dá)量降低，在12h，24h，36h和48h，hccda5基因表達(dá)量明顯低于正常水平，其中36h hccda5基因表達(dá)量最低，60h后基因表達(dá)量回復(fù)到正常水平，結(jié)果表明BtCry1Ab35蛋白可以引起hccda5基因表達(dá)量下調(diào)。
　　體外合成hccda5基因特異dsRNA，進(jìn)

5、行hccda5基因在昆蟲細(xì)胞Sf9中的轉(zhuǎn)錄后沉默實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染重組病毒后的60h、72h和84h，hccda5基因在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)完全被dsRNA-1和dsRNA-2沉默;但是在轉(zhuǎn)染重組病毒后96h，在實(shí)驗(yàn)組中重組蛋白HcCDA5被檢測(cè)到，但其表達(dá)量仍低于對(duì)照組;且不同序列、不同長(zhǎng)度的dsRNA在hccda5轉(zhuǎn)錄后沉默實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出相同的沉默效應(yīng)。此結(jié)果為通過注射dsRNA，研究HcCDA5在美國(guó)白蛾幼蟲中的生物學(xué)功能奠定了基