黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)及機(jī)制探討.pdf

1、目的：由單層的腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞間的連接組成的機(jī)械屏障是腸黏膜屏障中重要的組成部分，可抵御外來(lái)微生物及毒素的入侵。其中緊密連接是細(xì)胞間重要的連接方式，緊密連接的完整性對(duì)維持腸黏膜功能具有至關(guān)重要的作用。機(jī)體內(nèi)脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)含量增加，可破壞緊密連接完整性，損傷腸黏膜屏障功能，而腸黏膜屏障功能受損，細(xì)胞旁屏障滲透性增加，又可導(dǎo)致腸道細(xì)菌和（或）LPS進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，形成惡性循環(huán)，危害機(jī)體健康。黃芩苷(b

2、aicalin)是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類(lèi)活性成分，具有廣泛的藥理作用，尤其在抗炎及治療腸道疾病方面具有良好的藥效。本研究旨在從細(xì)胞水平和分子水平方面探討黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞的保護(hù)作用，一方面為闡明黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的IEC-6的細(xì)胞增殖、炎性反應(yīng)、凋亡、遷移能力及細(xì)胞間緊密連接等的保護(hù)作用及其相關(guān)作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ);另一方面為細(xì)菌導(dǎo)致的腸黏膜屏障損傷及相關(guān)疾病的藥物研發(fā)提供新的思路和依據(jù)。
　　方法：采用MT

3、T法對(duì)黃芩苷進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。用不同濃度的LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞，采用MTT法和ELISA分別檢測(cè)LPS對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖及分泌IL-6和TNF-α的影響，確定建立細(xì)胞炎癥模型的LPS濃度。采用MTT法和ELISA檢測(cè)黃芩苷對(duì)模型細(xì)胞增殖及分泌炎癥因子IL-6和TNF-α的影響;采用Hoechst33258染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃芩苷對(duì)模型細(xì)胞細(xì)胞核凋亡形態(tài)學(xué)改變及凋亡率的影響;采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)探討黃芩苷對(duì)模型細(xì)胞遷移能力的影響;采

4、用qRT-PCR法檢測(cè)黃芩苷對(duì)模型細(xì)胞Claudin-3、Occludin和ZO-1等mRNA表達(dá)的影響;采用細(xì)胞免疫化學(xué)法和Western blot檢測(cè)黃芩苷對(duì)以上有表達(dá)差異的基因進(jìn)行蛋白表達(dá)的檢測(cè)。
　　結(jié)果：⑴與對(duì)照組比較，2.5、5.0和10.0μ g/mL黃芩苷組細(xì)胞生存率均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。⑵與對(duì)照組比較，1.0μ g/mL LPS組IEC-6細(xì)胞生存率顯著降低（P＜0.01）;IL-6和TNF-α分泌量及細(xì)

5、胞凋亡率均明顯增加（均為P＜0.01）;部分細(xì)胞核凋亡形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為亮藍(lán)色的細(xì)胞核固縮和細(xì)胞核碎裂呈分葉狀;細(xì)胞遷移能力明顯下降（P＜0.01）;Claudin-3 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05），而Occludin和ZO-1 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)（均為P＜0.01）;緊密連接Occludin和ZO-1蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞，分布較散，連接之間出現(xiàn)較長(zhǎng)距離的斷裂;此外，ZO-1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01

6、）。⑶與模型組比較，5.0和10.0μg/mL黃芩苷組細(xì)胞生存率明顯提高（P＜0.01）;2.5、5.0和10.0μg/mL黃芩苷組凋亡細(xì)胞均減少，其中10.0μg/mL黃芩苷組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），絕大多數(shù)細(xì)胞細(xì)胞核大小均一，呈圓形或橢圓形，未出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)學(xué)改變;細(xì)胞遷移能力明顯提高(P＜0.01)。同時(shí)，10.0μ g/mL黃芩苷組細(xì)胞IL-6和TNF-α分泌量顯著減少(分別為P＜0.05 P＜0.01）;ZO-1

7、 mRNA的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），但Occludin mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）;細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1分布明顯改善，甚至恢復(fù)至正常水平，而Occludin蛋白的分布未見(jiàn)明顯改善;此外，ZO-1蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：①LPS能抑制正常IEC-6細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡及分泌炎癥因子IL-6和TNF-α，同時(shí)降低細(xì)胞遷移能力及IEC-6細(xì)胞Occludin、ZO-1 mRNA和蛋白