姜黃素氫化物的抗炎、抗腹水瘤活性研究.pdf

1、目的:
　　姜黃素(Curcumin，CUR)是從姜科植物根莖中分離出來的二酮類色素，具有抗炎、抗氧化、促凋亡等多方面藥理活性，耐受性好，毒性低，具有很好的臨床應用價值。然而，姜黃素在水溶液中溶解性很差，結構不穩(wěn)定，口服生物利用率低，導致其臨床應用存在諸多困難。因此，尋找姜黃素在體內(nèi)代謝中發(fā)揮作用的活性形式，具有極其重要的研究意義。本課題擬以姜黃素在生物體內(nèi)的初級氫化代謝產(chǎn)物之一:四氫姜黃素(Tetrahydrocurcumin，

2、THC)和次級氫化代謝產(chǎn)物之一:八氫姜黃素(Octahydrocurcumin，OHC)與姜黃素進行對比研究，探討其在抗炎、抗腹水瘤中的藥理活性差異，并對其作用機理進行初步闡釋，為姜黃素在臨床上的合理利用提供實驗基礎。
　　方法:
　　1.OHC的合成及THC、OHC急性毒性的初步研究
　　利用硼氫化鈉(NaBH4)對姜黃素結構中的兩個羰基(C=O)進行氫化，通過控制條件，設計合成OHC，并利用液質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-

3、MS)，核磁共振譜(1H-NMR和13C-NMR)對其進行檢測，與已報道的OHC文獻色譜數(shù)據(jù)對比驗證其結構和純度;采取半數(shù)致死量實驗以及最大耐受量實驗兩種方法，評價THC和OHC的小鼠最大給藥量和急性毒性反應。
　　2.姜黃素氫化物的抗炎作用研究
　　KM小鼠連續(xù)7天，每天1次口服給藥給予THC和OHC各三個劑量組(10、20、40 mg/kg)及CUR單劑量組(100mg/kg)，第7天給藥1小時后，進行二甲苯致小鼠耳腫脹

4、實驗、醋酸致小鼠毛細血管通透性實驗以及角叉菜膠致小鼠足腫脹實驗，測量統(tǒng)計小鼠左、右耳的重量、腹腔灌洗液的OD值以及致炎前后足部體積差異，計算耳腫脹率及耳腫脹抑制率、通透性增強度和抑制率以及足腫脹百分率和足腫脹抑制率。
　　KM小鼠連續(xù)7天，每天1次口服給藥給予THC和OHC單劑量組40 mg/kg及CUR單劑量組100 mg/kg，第7天給藥1小時后，進行角叉菜膠致小鼠足腫脹實驗，于造模4小時后，處死小鼠，取各組小鼠的足部組織，測

5、定足部組織中COX-1、COX-2和NF-κB的活性，測定足部組織中TNF-α，IL-1β，IL-6，PGE2，TAB1、TAK1和p-TAK1的含量。
　　3.姜黃素氫化物的抗腹水瘤活性研究
　　復制H22腹水瘤KM小鼠模型，口服給藥給予THC和OHC各三個劑量組(5、10、20mg/kg)及CUR單劑量組(100mg/kg)，連續(xù)7天，每天1次，觀察各組小鼠日常情況，統(tǒng)計小鼠生存周期，繪制生存曲線，比較組間差異;連續(xù)7天

6、口服給藥給予THC和OHC單劑量組(20 mg/kg)及CUR單劑量組(100mg/kg)，每天1次，測定小鼠體重、腹圍，第7天給藥1小時后，處死小鼠，測定小鼠腹腔腹水量、細胞活力及免疫臟器重量，檢測各組H22腹水瘤細胞的凋亡率，檢測MDM2、p53、Bax、Bcl-2、cytochrome C、caspase-9和caspase-3在蛋白水平上的表達情況。
　　結果:
　　1.OHC的合成及THC、OHC急性毒性的初步研究

7、結果分析
　　采用上述方法進行合成純化后，其結構經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀(HPLC-MS)，核磁共振譜(1H-NMR和13C-NMR)檢測，與已經(jīng)報道文獻的OHC色譜數(shù)據(jù)對比，證明合成的化合物即為OHC，且純度為98.06％;此外，THC和OHC的半數(shù)致死量無法檢測，THC或OHC的小鼠灌胃給藥單次最大耐受量實驗結果提示兩者均大于5g/kg。
　　2.姜黃素氫化物的抗炎作用研究
　　小鼠耳腫脹實驗中，模型組小鼠右耳與左耳重量相比具

8、有統(tǒng)計學意義，提示造模成功，與模型組相比，THC及OHC各劑量組、CUR單劑量組和陽性(Indo)組均可顯著減輕耳腫脹度，且THC及OHC各給藥組呈劑量依賴關系，與CUR相比，THC(40 mg/kg)和OHC(40 mg/kg)兩組對小鼠耳腫脹有更強的抑制效果;小鼠通透性實驗中，模型組小鼠OD值與空白小鼠相比具有統(tǒng)計學意義，提示造模成功，與模型組相比，THC及OHC各劑量組、CUR單劑量組和陽性(Indo)組均可顯著減少小鼠腹腔灌洗液

9、的OD值，且THC及OHC各給藥組呈劑量依賴關系，與CUR相比，THC(40 mg/kg)和OHC(40 mg/kg)兩組對毛細血管通透性有更強的抑制效果;小鼠足腫脹實驗中，模型組小鼠足部體積與造模前小鼠足部體積相比具有統(tǒng)計學意義，提示造模成功，與模型組相比，THC及OHC各劑量組、CUR單劑量組和陽性(Indo)組均可顯著減少造模小鼠足部腫脹體積，且THC及OHC各給藥組呈劑量依賴關系，此外，THC(40 mg/kg)和OHC(40

10、mg/kg)兩組的效果強于CUR;進一步研究證實，THC和OHC可以選擇性抑制COX-2的活性，對COX-1無影響，并抑制NF-κB的活性，降低TNF-α，IL-1β，IL-6，PGE2，TAB1和p-TAK1的含量，提高TAK1的含量，且與CUR相比，THC(40 mg/kg)和OHC(40 mg/kg)兩組對角叉菜膠所致的足部腫脹有更強的抑制效果。
　　3.姜黃素氫化物的抗腹水瘤活性研究
　　各劑量組均可顯著提升小鼠的生

11、命天數(shù)，降低小鼠體重、腹圍、腹腔腹水量和細胞活力，對免疫臟器無不良影響，提高細胞凋亡率，抑制MDM2和Bcl-2的活性，增強p53、Bax、cytochrome C、caspase-9和caspase-3的活性，且與CUR相比，THC和OHC對H22腹水瘤小鼠具有更好的治療效果。
　　結論:
　　實驗結果表明OHC的合成方法安全有效，且純度很高;此外，THC和OHC的急性毒性測試提示兩者的急性毒性均非常小，使用安全性很高;體