葛根素對(duì)慢性缺血誘發(fā)的血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　慢性腦灌注不足(CCH)可能導(dǎo)致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病或精神疾病，CCH與學(xué)習(xí)和記憶功能障礙密切相關(guān)，尤其是血管性癡呆，表現(xiàn)為認(rèn)知障礙和行為不良，CCH動(dòng)物模型可以由中斷兩側(cè)頸動(dòng)脈主干的大鼠制備（稱作2VO大鼠），2VO大鼠腦血流量不足導(dǎo)致大腦皮層、海馬體和白質(zhì)慢性低灌注，從而發(fā)生認(rèn)知功能障礙和不良的新陳代謝，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，可發(fā)生血管性癡呆。據(jù)報(bào)道稱腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）為內(nèi)環(huán)境平衡的重要調(diào)控系統(tǒng)，并被認(rèn)為是治

2、療慢性腦灌注不足CCH誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙的潛在靶點(diǎn)。
　　血管性癡呆主要病因之一是腦血流量減少誘發(fā)的活性氧(ROS)的過度表達(dá)?；钚匝醯某磉_(dá)作為RAS過程一部分，可作為氧化應(yīng)激開始的標(biāo)志，這被定義為活性氧ROS和與抗氧化反應(yīng)間平衡被打破的標(biāo)志。過量的ROS和自由基會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，包括膜脂質(zhì)過氧化作用，DNA斷裂及損傷和蛋白質(zhì)損失，在大腦中，活性氧的過量產(chǎn)生能夠?qū)е律窠?jīng)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡及細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致永久性神經(jīng)損

3、傷。ROS生成和其有害影響不僅在血管性癡呆存在，也見于中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性、出血性及再灌注條件下的病變。就這一點(diǎn)而言，ROS清除化合物在各種疾病模型中被廣泛測(cè)試以減少活性氧水平。
　　葛根素，一種異黃酮，可以在許多植物和草藥中發(fā)現(xiàn)，如葛根的根。葛根素也是常用于治療發(fā)燒和腹瀉的中藥。事實(shí)證明，葛根素具有清除活性氧和減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的能力。葛根素也被證明在不同種類的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有神經(jīng)保護(hù)作用，如阿爾茨海默氏癥，帕金森氏病和腦缺血。關(guān)

4、于葛根素的保護(hù)作用，其清除活性氧的能力是在大部分的研究中被重點(diǎn)提及的。一些研究還關(guān)注到葛根素在特殊的細(xì)胞類型中具有抗凋亡的活力。然而關(guān)于葛根素對(duì)血管性癡呆的保護(hù)作用目前尚無此類研究。
　　在本研究中，我們?cè)噲D通過2 VO大鼠模型驗(yàn)證葛根素對(duì)慢性缺血引起的血管性癡呆具有保護(hù)作用。進(jìn)一步驗(yàn)證葛根素能夠減輕血管性癡呆所致的認(rèn)知和行為障礙。推論葛根素在2 VO大鼠模型中的保護(hù)作用可能是通過清除ROS以減少氧化應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到的。
　　方

5、法：
　　6到8周成年雄性Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)由中斷兩側(cè)頸動(dòng)脈主干制備2VO大鼠模型，給予或不給予葛根素治療。采用莫里斯水迷宮測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。丙二醇(MDA)，谷胱甘肽過氧化物酶和總硫醇評(píng)估用于反映腦組織的氧化應(yīng)激。SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)后給予過氧化氫模擬氧化應(yīng)激，給予或不給予葛根素治療，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8(CCK8)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行檢查細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)及給予不同濃度葛根素治療后的生存率和凋亡率。

6、活性氧(ROS)的產(chǎn)生由2'，7'二氯熒光素二乙酸(DCFH-DA)檢驗(yàn)。采用qPCR和Western blot(WB)方法測(cè)試Nrf2、FoxO1 FoxO3和FoxO4.基因表達(dá)的變化，探討葛根素的分子作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、莫里斯水迷宮試驗(yàn)中2VO組動(dòng)物逃脫時(shí)間比假手術(shù)組呈現(xiàn)顯著延遲(P＜0.05)。在2VO加葛根素干預(yù)組中逃脫時(shí)間較2VO組明顯縮短，改變顯著(P＜0.05)。假手術(shù)組動(dòng)物給予葛根素干預(yù)后逃脫時(shí)

7、間未見明顯改變。在目標(biāo)象限花費(fèi)的時(shí)間測(cè)試中，2VO模型組在目標(biāo)象限區(qū)域花費(fèi)的平均時(shí)間較短，與假手術(shù)組差異顯著(P＜0.05)。在2VO加葛根素干預(yù)組在目標(biāo)象限區(qū)域花費(fèi)的平均時(shí)間有所延長(zhǎng)，與2VO差異顯著(P＜0.05)。假手術(shù)組動(dòng)物給予葛根素干預(yù)后在目標(biāo)象限區(qū)域花費(fèi)的平均時(shí)間沒有任何改變。四組動(dòng)物的游泳速度無顯著差異。
　　2、在2VO組海馬和額葉皮質(zhì)區(qū)的丙二醛含量較假手術(shù)組明顯提高(P＜0.05);葛根素干預(yù)組可以顯著下調(diào)海馬和

8、額葉皮層升高的MDA水平(P＜0.05);假手術(shù)組給予葛根素干預(yù)對(duì)丙二醛含量沒有任何影響。
　　2VO組的谷胱甘肽過氧化物酶濃度較假手術(shù)組較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);葛根素干預(yù)組顯示了葛根素對(duì)谷胱甘肽過氧化物酶濃度較大部分修復(fù)作用(P＜0.05);假手術(shù)組給予葛根素干預(yù)與假手術(shù)組比較未顯示任何差異。
　　2VO組的總硫醇濃度較假手術(shù)組顯著減少;葛根素干預(yù)組可以部分提高2VO組減少的總硫醇濃度;假手術(shù)組給予葛根素干預(yù)

9、與假手術(shù)組比較未顯示任何有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化。
　　3、以過氧化氫作為氧化應(yīng)激物刺激SH-SY5Y細(xì)胞后，給予或不給予葛根素治療均評(píng)估細(xì)胞的存活率。葛根素治療在三個(gè)不同濃度:0.1 umol/l,0.5 umol/l和1 umol/l。分別在12小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，過氧化氫誘發(fā)的氧化應(yīng)激在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均下調(diào)細(xì)胞的存活率。葛根素治療上調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞存活率呈劑量依賴性。1umol/l葛根素治療組改

10、善效果最好，幾乎達(dá)到對(duì)照組的相同水平。然后我們檢測(cè)了氧化應(yīng)激后的細(xì)胞凋亡率，結(jié)果與前相反，葛根素治療降低SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性，1umol/l葛根素治療組改善效果最好，幾乎達(dá)到對(duì)照組相同的水平。
　　4、為了進(jìn)一步探索葛根素對(duì)活性氧的清除能力，我們?cè)赟H-SY5Y細(xì)胞中通過DCFH-DA測(cè)定做ROS清除能力試驗(yàn)。細(xì)胞內(nèi)ROS水平通過DCFH-DA來分析，因?yàn)镈CFH-DA在細(xì)胞間具有滲透性，且對(duì)氧化敏感。給予氧

11、化氫誘導(dǎo)24小時(shí)后，培養(yǎng)基換做含有不同劑量葛根素的培養(yǎng)基。葛根素治療12小時(shí)或24小時(shí)后，通過DCFH-DA分析測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。DCF熒光強(qiáng)度的定量分析顯示給予過氧化氫誘導(dǎo)的未治療組顯示熒光水平最高。葛根素治療組的ROS陽性細(xì)胞數(shù)在12小時(shí)和24小時(shí)均顯著下調(diào)。1 umol/l濃度葛根素組與其他組比較顯示最好的活性氧清除能力(P＜0.05)。葛根素減少SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)DCF熒光存在明顯劑量依賴性。
　　5、通過qPCR和

12、免疫印跡進(jìn)行測(cè)試Nrf2、FoxO1 FoxO3和FoxO4.基因表達(dá)的變化。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，雖然葛根素治療組可以顯著提高Nrf2 mRNA的表達(dá)，但過氧化氫對(duì)Nrf2的mRNA水平并沒有影響。至于FoxO家族，通過氧化氫誘導(dǎo)FoxO1 FoxO3 FoxO4提高了在mRNA水平表達(dá)。葛根素治療增強(qiáng)了過氧化氫的FoxO1 FoxO3 FoxO4在mRNA水平表達(dá)增高的效應(yīng)(P＜0.05)。這個(gè)結(jié)果與通過WB檢測(cè)的蛋白水平的結(jié)果是一致的。

13、WB圖像的定量分析顯示，這些抗氧化應(yīng)激基因的表達(dá)是根據(jù)mRNA水平改變情況以不同的模式被上調(diào)的。
　　結(jié)論：
　　1、研究結(jié)果表明，無論是體內(nèi)環(huán)境慢性缺血誘發(fā)的還是體外過氧化氫誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，葛根素干預(yù)后均可以有明顯逆轉(zhuǎn)作用。對(duì)于2VO老鼠，葛根素干預(yù)也會(huì)提高學(xué)習(xí)能力和鞏固記憶，我們發(fā)現(xiàn)葛根素的保護(hù)作用都與葛根素對(duì)ROS的清除能力密切相關(guān)，無論是慢性缺血誘發(fā)的還是體外過氧化氫誘發(fā)的反應(yīng)，此現(xiàn)象也能解釋葛根素體外試驗(yàn)的抗凋

14、亡活力。在分子水平，我們發(fā)現(xiàn)葛根素的治療作用與幾種抗氧化蛋白表達(dá)相關(guān)，mRNA水平，Nrf2、FoxO1 FoxO3和FoxO4蛋白質(zhì)水平均顯著上調(diào)。還有一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)，過氧化氫處理也可以上調(diào)Nrf2的表達(dá)。
　　2、我們的研究中2VO老鼠被選為體內(nèi)動(dòng)物模型，雙側(cè)的頸總動(dòng)脈結(jié)扎可能導(dǎo)致大腦全球缺血。兩個(gè)目標(biāo)區(qū)域，即海馬和額葉皮質(zhì)，幾乎全部受到這個(gè)缺血影響，其中海馬負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶功能。然后我們使用莫里斯水迷宮測(cè)試每組的學(xué)習(xí)和記憶功能

15、。所有結(jié)果表明葛根素對(duì)2VO老鼠受損的學(xué)習(xí)和記憶能力具有保護(hù)作用。
　　3、已經(jīng)證實(shí)氧化應(yīng)激在缺血和缺氧性腦損傷中扮演著關(guān)鍵角色。氧化應(yīng)激也與炎性細(xì)胞因子的過度表達(dá)和血管受損導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙相關(guān)?；钚匝跄軌蜓趸づD質(zhì)，細(xì)胞蛋白質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的核酸，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙?？紤]到這個(gè)，我們重點(diǎn)關(guān)注2VO大鼠腦組織中ROS的過度生成和自由基的產(chǎn)生，我們測(cè)量了MDA的水平，這是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一個(gè)標(biāo)志。谷胱甘肽過氧化酶和硫醇含量分別測(cè)量體

16、外試驗(yàn)中對(duì)抗活性氧生成的酶促和非酶促性防御反應(yīng)。為了進(jìn)一步解釋葛根素在體外試驗(yàn)中對(duì)ROS的清除能力，選取SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，給予過氧化氫作為刺激物施加刺激，模擬體內(nèi)狀態(tài)時(shí)缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。我們的結(jié)果指出葛根素治療能夠減少過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)葛根素治療部分逆轉(zhuǎn)了過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的不利影響，呈計(jì)量依賴性。
　　4、為了探索其潛在機(jī)制，我們重點(diǎn)關(guān)注調(diào)控因子FOX O家族(FoxO)和Nrf2的表達(dá)。F

17、oxO家族通過提高幾種抗氧化酶的氧化還原信號(hào)的表達(dá)以減少ROS生成。FoxO家族蛋白質(zhì)也是調(diào)控細(xì)胞增殖，分化，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期逮捕和自噬的轉(zhuǎn)錄因子。另一個(gè)我們關(guān)注Nrf2基因，也調(diào)節(jié)對(duì)氧化損害有保護(hù)作用的抗氧化蛋白質(zhì)。FoxO家族和Nrf2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的生理功能和病理作用。我們首次報(bào)道了葛根素治療作用與上調(diào)缺血大腦中的這些基因具有相關(guān)性。總之，我們猜測(cè)葛根素對(duì)慢性腦缺血誘發(fā)的血管性癡呆具有保護(hù)作用表現(xiàn)在減輕氧化應(yīng)激和提高認(rèn)知