白藜蘆醇通過抑制卵巢癌細胞糖酵解激活AMPK-mTOR信號通路促進卵巢癌細胞凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　本課題擬從細胞水平探索白藜蘆醇對于卵巢癌細胞生物學特性的影響，包括增殖、遷移、侵襲、凋亡，并探索其對于不同卵巢癌細胞系的IC50藥物濃度，進一步揭示白藜蘆醇對于卵巢癌細胞糖酵解的影響，分別從基因、蛋白水平驗證白藜蘆醇的抗腫瘤作用及其可能機制并從動物實驗模型角度驗證了其抗腫瘤效果。
　　方法：
　　1、采用MTT法檢測梯度濃度的白藜蘆醇(25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM)對于

2、人卵巢癌A2780/SKOV3細胞的增殖抑制作用并計算白藜蘆醇對于卵巢癌細胞系的IC50用于后續(xù)實驗，檢測白藜蘆醇對于人正常卵巢上皮細胞（IOSE-80）和肺上皮細胞(BEAS-2B)的毒性作用。
　　2、采用細胞劃痕及Transwell實驗檢測白藜蘆醇對于人卵巢癌A2780和SKOV3細胞遷移、侵襲能力的影響。
　　3、流式細胞儀檢測白藜蘆醇作用于A2780和SKOV3細胞24h、48h及72h后，兩細胞系的凋亡率變化情況

3、。
　　4、葡萄糖氧化酶法和乳酸氧化酶法檢測白藜蘆醇對于卵巢癌細胞糖酵解的影響。
　　5、qRT-PCR檢測200μM/100μM白藜蘆醇分別作用于A2780/SKOV3細胞48h后細胞中AMPK、mTOR和Caspase3mRNA的表達水平。
　　6、Western blots檢測白藜蘆醇以及Compound C共培養(yǎng)卵巢癌細胞A2780/SKOV3細胞72h后AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR和Clea

4、ved Caspase3、Caspase3蛋白的表達情況，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。
　　7、SKOV3細胞建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，分別予以腹腔注射白藜蘆醇溶液(100mg/kg)和溶劑（10％乙醇），對比兩組腫瘤大小、重量及肝腎、腫瘤的HE染色及Ki-67免疫組化染色。
　　結果：
　　1、梯度濃度的白藜蘆醇對于卵巢癌A2780和SKOV3細胞皆有抑制增殖作用，并呈濃度依賴關系，但白藜蘆醇對于正常細胞抑制作用較弱

5、。
　　2、劃痕實驗及Transwell實驗結果顯示白藜蘆醇顯著抑制A2780和SKOV3細胞遷移和侵襲。
　　3、流式細胞儀結果顯示白藜蘆醇作用于A2780和SKOV3細胞后，細胞凋亡率增加，并呈時間依賴關系(F=143.557，P＜0.001;F=86.121，P＜0.001)。
　　4、200μM/100μM白藜蘆醇作用于A2780/SKOV3細胞12h后，上清葡萄糖消耗量減少，乳酸生成量減少（均P＜0.01）;

6、
　　5、200μM/100μM白藜蘆醇分別作用于A2780/SKOV3細胞48h后，熒光定量PCR顯示AMPK和Caspase3表達量增加，而mTOR表達量降低(均P＜0.05)。
　　6、白藜蘆醇作用于A2780/SKOV3細胞72h后，細胞中p-AMPK和CleavedCaspase3蛋白條帶灰度增加，而p-mTOR蛋白條帶變細、灰度降低。而CompoundC(10μM，AMPK特異性抑制劑)與白藜蘆醇共培養(yǎng)卵巢癌細胞

7、72h后，細胞活力高于白藜蘆醇單獨處理組，且細胞中p-AMPK和Cleaved Caspase3蛋白條帶灰度較白藜蘆醇組降低，而p-mTOR蛋白條帶灰度較白藜蘆醇組灰度增加(均P＜0.05)。
　　7、白藜蘆醇組裸鼠皮下移植瘤生長速度顯著低于對照組(F=36.443，P＜0.001)，皮下移植瘤重量低于對照組(t=2.940，P=0.019)，且Ki-67評分顯著低于對照組(t=6.843;P＜0.001)。
　　8、對照組

8、裸鼠4例出現(xiàn)卵巢癌肝臟轉移，而白藜蘆醇治療組僅1例出現(xiàn)肝臟轉移，兩組轉移指數(shù)分別為2.2和0.4(P=0.038)。
　　結論：
　　1、白藜蘆醇呈濃度依賴性抑制人卵巢癌A2780和SKOV3細胞增殖并促進其凋亡，但與A2780相比，SKOV3對于白藜蘆醇更為敏感，提示不同卵巢癌細胞系對于白藜蘆醇的敏感性具有差異。
　　2、白藜蘆醇抑制人卵巢癌A2780和SKOV3細胞遷移和侵襲。
　　3、白藜蘆醇可抑制人卵巢癌