TOFA抑制卵巢癌細(xì)胞增殖活性及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:乙酰輔酶A羧化酶A在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其意義
　　目的:
　　檢測(cè)正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織及上皮性卵巢癌組織中乙酰輔酶A羧化酶A(AcetylCoaCarboxylaseA，ACCA)中的表達(dá)及其意義。
　　方法:
　　RT-PCR和Real-timePCR方法檢測(cè)DNA水平各種卵巢組織中ACCA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　正常卵巢組織中ACCA的相對(duì)表達(dá)含量為7.35±12.2

2、1％，良性卵巢腫瘤組織中ACCA的相對(duì)表達(dá)含量為39.76±14.87％，上皮性卵巢癌組織中ACCA的平均相對(duì)表達(dá)含量為42.86±13.44％，和正常卵巢組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，良性卵巢腫瘤組織和上皮性卵巢組織相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　良性卵巢腫瘤和上皮性卵巢癌組織中ACCA的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織，說明卵巢腫瘤組織中存在ACCA過表達(dá)，可能成為預(yù)測(cè)卵巢腫瘤的有效分子指標(biāo)。

3、
　　第二部分:TOFA抗卵巢癌細(xì)胞增殖活性及機(jī)制
　　目的:
　　探討乙酰輔酶A羧化酶抑制劑TOFA對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞及順鉑耐藥亞株增殖效應(yīng)、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制。
　　方法:
　　應(yīng)用細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)TOFA對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞COG1及順鉑耐藥細(xì)胞株COC1/DDP增殖抑制效應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡的情況，Werternblot方法檢測(cè)TOFA處理后上皮性

4、卵巢癌細(xì)胞中PI3K/AKT及MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的變化，細(xì)胞周期蛋白凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度的TOFA(1、5、10、20、50μg/ml)分別作用24、48、72小時(shí)后，對(duì)COC1及COC1/DDP的增殖抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴。COC1和COC1/DDP細(xì)胞的IC50分別為26.10μg/ml和11.59μg/ml。
　　2.低濃度TOFA（10μg/ml）作用24、48、

5、72小時(shí)后，能有效誘導(dǎo)COC1細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)分別為62.01％、55.84％和54.78％，對(duì)照組分別為29.92％、28.14％和34.55％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TOFA對(duì)COC1/DDP無明顯的細(xì)胞周期阻滯作用。
　　3.低濃度TOFA作用24、48、72小時(shí)后，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。10μg/mlTOFA作用COC1細(xì)胞后凋亡率為12.38％、42.59％、43.88％，和對(duì)照組

6、相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);5μg/mlTOFA作用COC1/DDP細(xì)胞48h、72h的凋亡率分別為32.16％、42.05％，和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.TOFA作用COC1細(xì)胞后，抑制MAPK/ERK通路活化，在COC1和COC1/DDP細(xì)胞中能激活Caspase-3蛋白，抑制凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá);下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1及CDK4表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　T

7、OFA能有效抑制卵巢癌細(xì)胞及順鉑耐藥亞株增殖，呈時(shí)間和劑量依賴性;誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯，和下調(diào)CyclinD1及CDK4蛋白表達(dá)相關(guān);誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，激活Caspase-3凋亡通路，抑制Bcl-2蛋白表達(dá);并下調(diào)ERK蛋白表達(dá)，TOFA發(fā)揮作用的機(jī)制可能與MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。
　　第三部分:TOFA增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞化療敏感性的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　探討TOFA與紫杉醇(TAX)和順鉑(DDP)聯(lián)合應(yīng)用

8、后對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞及順鉑耐藥亞株的增殖抑制效應(yīng)、細(xì)胞周期及凋亡情況的影響。
　　方法:
　　應(yīng)用細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)不同濃度TOFA聯(lián)合TAX和DDP對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞及順鉑耐藥亞株增殖抑制效應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡變化。
　　結(jié)果:
　　1.TOFA和TAX聯(lián)合應(yīng)用后能有效抑制COC1細(xì)胞增殖，低濃度TOFA(5μg/ml)+TAX(25nM)組和TOFA(10μg/ml)+TAX

9、(50nM)組作用48h及72h呈協(xié)同作用。TOFA(1μg/ml)+DDP(1μM)組和TOFA(5μg/ml)+DDP(5μM)聯(lián)合48h及72h同樣呈協(xié)同作用，與單一用藥組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TOFA和TAX、DDP聯(lián)合后抑制COC1/DDP細(xì)胞增殖，并呈協(xié)同作用。
　　2.TOFA和TAX聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)COC1細(xì)胞G0/G1期阻滯，但對(duì)COC1/DDP細(xì)胞則誘導(dǎo)G2/M期阻滯;TOFA+DDP誘導(dǎo)COC1細(xì)

10、胞和COC1/DDP細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。
　　3.TOFA+TAX組和TOFA+DDP組均可誘導(dǎo)COC1細(xì)胞和COC1/DDP細(xì)胞凋亡，并呈協(xié)同作用。
　　4.細(xì)胞經(jīng)TOFA處理后，COC1對(duì)DDP和TAX的敏感性明顯提高，對(duì)DDP和TAX的耐藥倍數(shù)分別為0.36和0.21;TOFA處理的COC1/DDP細(xì)胞對(duì)TAX的敏感性明顯提高，耐藥倍數(shù)為0.44。但對(duì)DDP的敏感性降低，出現(xiàn)部分耐藥，耐藥倍數(shù)為1.31。
　

11、　結(jié)論:
　　TOFA+TAX組和TOFA+DDP組可有效抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞COC1和順鉑耐藥亞株COC1/DDP細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)不同細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡，呈協(xié)同作用。低劑量的TOFA和TAX及DDP聯(lián)合后能更有效地抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，為探討新的化療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第四部分:TOFA對(duì)卵巢癌荷瘤小鼠的治療作用
　　目的:
　　應(yīng)用動(dòng)物模型研究TOFA對(duì)卵巢癌荷瘤小鼠的治療作用。
　　方法:<

12、br>　　選取鼠齡4-5周，雌性、體重17-20gBALB/c裸小鼠，分別收集COC1和COC1/DDP細(xì)胞2×106個(gè)，100μlRPMI-1640培養(yǎng)基重懸，接種于裸小鼠雙側(cè)大腿外側(cè)皮下。荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組，每組5只:(1)對(duì)照組;(2)DMSO組（腹腔注射）;(3)TOFA處理組(50mg/kg);(4)DDP處理組（5mg/kg）;(5)TOFA和DDP聯(lián)合處理組。每3天給一次藥，腹腔注射，連續(xù)治療2周。給藥過程中檢測(cè)裸鼠腫瘤

13、體積，給藥4周后處死。腫瘤體積計(jì)算公式為，體積=A×B2×0.5236（A:長(zhǎng)，B:寬，單位為毫米）。
　　結(jié)果:
　　1.單純應(yīng)用TOFA治療組和對(duì)照組相比無明顯治療效果，將TOFA和傳統(tǒng)化療藥物DDP聯(lián)合應(yīng)用治療COC1荷瘤小鼠后，和對(duì)照組相比，腫瘤體積明顯減小(P＜0.05)，是對(duì)照組的48.3％（治療后第27天）。
　　2.應(yīng)用TOFA治療COC1/DDP荷瘤小鼠后，和對(duì)照組相比，腫瘤體積明顯減小(P＜0.05