mTORC1信號(hào)異常在孕期炎癥刺激致子代動(dòng)物血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制初探.pdf

1、高血壓及其所引發(fā)的其他心血管并發(fā)癥如腦卒中、冠心病和心梗等已經(jīng)成為人類致死和致殘的最大威脅之一。在廣泛的開(kāi)展了各級(jí)高血壓預(yù)防措施的情況下，其發(fā)病率居高不降，提示仍有未被發(fā)現(xiàn)的重要病因。血管重構(gòu)是血管內(nèi)膜增厚、內(nèi)徑縮窄以及血管內(nèi)部胞外基質(zhì)增多的過(guò)程，主要涉及細(xì)胞的肥大、增殖、遷移、凋亡以及胞外基質(zhì)的生成與降解紊亂。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為血管重構(gòu)是高血壓的繼發(fā)性改變;但本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，血管重構(gòu)也可能是高血壓發(fā)生的重要病因。因此，深入探索孕期炎

2、癥刺激子代動(dòng)物血管重構(gòu)發(fā)生的分子機(jī)制，已成為一個(gè)迫切需要解決的重要科學(xué)問(wèn)題。
　　mTOR信號(hào)通路可被包括炎癥、生長(zhǎng)因子、激素等激活，在整合了上游的多種信號(hào)后，通過(guò)其復(fù)合物向下傳遞包括調(diào)控細(xì)胞蛋白和脂質(zhì)合成、能量代謝、細(xì)胞存活及代謝、細(xì)胞骨架構(gòu)成等功能，在細(xì)胞的增殖、遷移等生命活動(dòng)上作用重大。結(jié)合課題組既往研究發(fā)現(xiàn)孕期炎癥刺激后子代大鼠炎癥反應(yīng)性增強(qiáng)、循環(huán)中l(wèi)eptin、TNF-α、IL-6及血管組織局部AngⅡ、TNF-α等促炎

3、因子水平顯著升高，我們推測(cè)mTOR的異常活化可能參與了孕期炎癥刺激致子代動(dòng)物血管重構(gòu)的形成、進(jìn)而導(dǎo)致高血壓的發(fā)病。
　　為此，本課題在孕期炎癥刺激致子代高血壓的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)評(píng)價(jià)mTOR異常活化對(duì)主動(dòng)脈血管重構(gòu)的影響并初步揭示相關(guān)的分子機(jī)制，探討高血壓致病的新機(jī)制并為其防治新靶標(biāo)的尋找提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.孕期炎癥刺激后子代大鼠不同時(shí)期mTOR信號(hào)通路活性改變規(guī)律
　　復(fù)制孕期炎癥暴露于脂多糖(LPS

4、)大鼠模型:孕鼠（SD大鼠）隨機(jī)分成兩組:對(duì)照組、LPS組，其中LPS組于孕第8、10、12天腹腔注射LPS(0.79mg/kg)，對(duì)照組于孕第8、10、12天腹腔注射生理鹽水。子代出生后監(jiān)測(cè)基礎(chǔ)體征;Western blot檢測(cè)子代大鼠1w、3w、5w、10w、15w、26w胸主動(dòng)脈mTORC1下游信號(hào)通路p-S6ser240/244以及mTORC2下游信號(hào)通路p-Aktser473的蛋白表達(dá)水平;
　　2.mTOR抑制劑雷帕霉

5、素對(duì)孕期炎癥刺激后子代大鼠血壓、血管重構(gòu)及內(nèi)皮功能的影響
　　2.1 mTOR通路在體干預(yù):將26周齡子代大鼠分為四組:Con+Ve、LPS+Ve、Con+Rapa、LP S+Rapa組，注射溶劑或雷帕霉素(1.5mg/kg/day)15天。尾套法檢測(cè)給藥期間血壓。干預(yù)至15天，取胸主動(dòng)脈，HE染色觀察給予雷帕霉素干預(yù)后胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的改變;Masson染色觀察胸主動(dòng)脈膠原纖維的變化;
　　2.2 western blot檢

6、測(cè)孕期刺激子代大鼠26周齡胸主動(dòng)脈p-eNOS、PCNA的表達(dá)情況以及給予雷帕霉素干預(yù)后的影響;
　　3.孕期炎癥刺激后子代小鼠mTOR信號(hào)通路活性觀察及血管平滑肌細(xì)胞敲低mTORC1活性對(duì)孕期炎癥刺激后子代小鼠血壓、血管重構(gòu)的影響
　　3.1 孕期炎癥暴露于脂多糖小鼠(c57)模型:于孕10.5天腹腔注射LPS(75μg/kg)或生理鹽水。子代出生后監(jiān)測(cè)基礎(chǔ)體征;WB檢測(cè)子代小鼠16周齡胸主動(dòng)脈mTORC1下游信號(hào)通路p-

7、S6ser240/244以及mTORC2下游信號(hào)通路p-Aktser473的蛋白表達(dá)水平;
　　3.2 孕期炎癥刺激血管平滑肌細(xì)胞mTORC1條件性敲低小鼠試驗(yàn):Itagx-cre小鼠與Raptor-floxp交配后F2代進(jìn)行基因鑒定，取基因型為ItagxcreRaptorf/wt小鼠復(fù)制孕期炎癥刺激小鼠模型，檢測(cè)子代小鼠血壓情況;HE染色觀察其胸主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變;
　　4.腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)異常在孕期炎癥刺激

8、后子代mTOR信號(hào)通路活性異常的作用
　　4.1 ACE抑制劑鹽酸貝那普利(飲水中250mg/L，40mg/kg/day)飲水給予15天耗竭內(nèi)源性AngⅡ后檢測(cè)胸主動(dòng)脈mTORC1信號(hào)通路中p-S6ser240/244以及mTORC2信號(hào)通路中p-Aktser473的蛋白表達(dá)水平;
　　4.2 ACE抑制劑鹽酸貝那普利(飲水中250mg/L，40mg/kg/day)飲水給予15天耗竭內(nèi)源性AngⅡ后再次給予外源性AngⅡ(1

9、05μg/kg)皮下注射后分別于0min，2min，5min，10min，30min，取胸主動(dòng)脈，檢測(cè)胸主動(dòng)脈mTORC1信號(hào)通路中p-S6ser240/244以及mTORC2信號(hào)通路中p-Aktser473的蛋白表達(dá)水平;
　　結(jié)果:
　　1.孕期炎癥刺激后子代大鼠不同時(shí)期mTOR信號(hào)通路活性改變規(guī)律
　　孕期炎癥刺激子代大鼠1周、3周、5周、10周、15周胸主動(dòng)脈mTORC1下游信號(hào)通路p-S6ser240/244

10、的表達(dá)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，至26周齡p-S6ser240/244的表達(dá)顯著增高(P＜0.01)，但mTORC2下游信號(hào)通路p-Aktser473的表達(dá)未出現(xiàn)明顯變化;
　　2.mTOR抑制劑雷帕霉素對(duì)孕期炎癥刺激后子代大鼠血壓、血管重構(gòu)及內(nèi)皮功能的影響
　　2.1 孕期炎癥刺激子代大鼠個(gè)體26周時(shí)血壓顯著升高（P＜0.01，與Con組相比），給予雷帕霉素干預(yù)后，部分逆轉(zhuǎn)了孕期炎癥刺激所導(dǎo)致的血壓升高(P＜0.0001);

11、　　2.2 HE染色觀察到，與Con+Ve組相比，LPS+Ve組胸主動(dòng)脈內(nèi)皮層完整性受損，內(nèi)彈力膜被破壞不連續(xù)，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，向內(nèi)皮層凸起，并且室壁厚度顯著增厚(P＜0.05)，胸主動(dòng)脈面積明顯增加(P＜0.05)，以及室壁厚度與內(nèi)徑比值也顯著增加(P＜0.05)，給予雷帕霉素干預(yù)后均能部分逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象;
　　2.3 Masson染色觀察到，LPS+Ve組胸主動(dòng)脈膠原沉積顯著增加（P＜0.05，與Con+Ve組相比），給予雷

12、帕霉素干預(yù)（LPS+Rapa組）后能明顯抑制孕期炎癥刺激所導(dǎo)致的子代膠原沉積的增加（P＜0.05，與LPS+Ve組相比）;
　　2.4 孕期炎癥刺激子代個(gè)體26周齡胸主動(dòng)脈低表達(dá)p-eNOS，給予雷帕霉素干預(yù)后能夠部分逆轉(zhuǎn)p-eNOS的低表達(dá);
　　2.5 孕期炎癥刺激子代個(gè)體26周齡胸主動(dòng)脈高表達(dá)PCNA，給予雷帕霉素干預(yù)后能夠部分緩解PCNA的異常表達(dá);
　　3.孕期炎癥刺激后子代小鼠mTOR信號(hào)通路活性觀察及血管

13、平滑肌細(xì)胞敲低mTORC1活性對(duì)孕期炎癥刺激后子代小鼠血壓、血管重構(gòu)的影響
　　3.1 孕期炎癥刺激子代小鼠16周齡胸主動(dòng)脈mTORC1信號(hào)通路中p-S6ser240/244的表達(dá)顯著增加（P＜0.05，與正常子代小鼠相比），mTORC2信號(hào)通路中p-Aktser473的表達(dá)無(wú)顯著差異;
　　3.2 相較于正常出生的子代小鼠，孕期炎癥刺激子代小鼠57周時(shí)血壓顯著升高，主動(dòng)脈室壁厚度增加，同時(shí)內(nèi)皮層凸起;而mTORC1在血管平

14、滑肌上的敲低可以顯著地恢復(fù)孕期炎癥刺激所導(dǎo)致的血壓升高，血管室壁厚度恢復(fù)正常，同時(shí)內(nèi)皮層也相對(duì)較為光滑，血管重構(gòu)得以改善;
　　4.腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)異常在孕期炎癥刺激后子代mTOR信號(hào)通路活性異常中的作用
　　4.1 孕期炎癥刺激子代大鼠26周齡，貝那普利干預(yù)15天后能降低孕期炎癥刺激所導(dǎo)致的血壓增高。同時(shí)貝那普利干預(yù)15天后，Con+BZ組與LPS+BZ組相比，胸主動(dòng)脈mTORC1下游信號(hào)通路p-S6ser24

15、0/244無(wú)顯著差異。結(jié)合我們前期發(fā)現(xiàn)的孕期炎癥刺激子代大鼠血管組織局部AngⅡ顯著增加而循環(huán)中AngⅡ無(wú)顯著變化，提示血管組織局部?jī)?nèi)源性AngⅡ水平增高是孕期炎癥刺激后子代大鼠mTORC1信號(hào)異常增高的重要原因;
　　4.2 孕期炎癥刺激子代大鼠26周齡，貝那普利干預(yù)15天后再次皮下注射外源性AngⅡ2min、5min、10min、30min，發(fā)現(xiàn)p-S6ser240/244的表達(dá)會(huì)隨著AngⅡ給藥時(shí)間的增加而增加，提示AngⅡ

16、可以使mTORC1活化;但對(duì)照組與LPS組之間p-S6ser240/244的表達(dá)無(wú)差異，p-Aktser473的表達(dá)也無(wú)差異。提示孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代大鼠mTOR信號(hào)通路的異常并非對(duì)AngⅡ在體內(nèi)反應(yīng)性的改變所引起。
　　結(jié)論:
　　1.孕期炎癥刺激致子代大鼠和小鼠胸主動(dòng)脈均存在mTORC1異?；罨?，而mTORC2無(wú)顯著改變;
　　2.子代大鼠和小鼠胸主動(dòng)脈mTORC1異?；罨窃衅谘装Y刺激子代血管重構(gòu)和血壓升高的重要