基于CRISPR的大腸桿菌分子分型方法的建立.pdf

1、大腸桿菌是寄宿在人體腸道內(nèi)的正常菌群，但部分血清型的大腸桿菌對(duì)人體是致病的，致病性的大腸桿菌可對(duì)人體造成多種疾病，如輕度腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒癥、尿路致病性感染等疾病。CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其具有高度的多態(tài)性，利用CRISPR位點(diǎn)的多態(tài)性可實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌分型。
　　目的：
　　1.通過生物信息學(xué)方法揭示大腸桿菌的結(jié)構(gòu)特征，描述CRISPR/Cas系統(tǒng)與插入序列之間的位置關(guān)系，探

2、討CRISPR1及CRISPR2.2位點(diǎn)之間的關(guān)系。
　　2.建立基于CRISPR的大腸桿菌分子分型方法，比較CCT、CLPST、MLST、Serotype四種分型方法的分型效果，分析四種分型方法之間的關(guān)系。
　　3.利用CRISPR分型方法預(yù)測(cè)大腸桿菌血清型，并評(píng)估其靈敏度及特異度。
　　方法：
　　1.CRT軟件及CRISPR finder在線工具獲得CRISPR位點(diǎn)信息，并提取間隔序列及重復(fù)序列，RNA f

3、old進(jìn)行重復(fù)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，CRISPR Target軟件進(jìn)行間隔序列外源同源性搜索，Mega6.0繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。
　　2.Serotype Finder在線工具獲得菌株血清學(xué)信息，Virulence Finder在線工具獲得菌株毒力基因信息，MLST Finder在線工具獲得菌株MLST信息。
　　3.Excel表對(duì)間隔序列進(jìn)行編號(hào)并繪制間隔序列圖譜，R軟件獲得CRISPR分型型別。
　　4.辛普森指數(shù)被用

4、于評(píng)估CCT、CLPST、MLST、Serotype四種分型方法的分型效果，Spearman相關(guān)性分析被用于獲得四種分型方法的相關(guān)系數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.大腸桿菌CRISPR位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析：283株全基因組測(cè)序的大腸桿菌可識(shí)別7種CRISPR位點(diǎn)，其中CRISPR1位點(diǎn)陽性率為81.62％，CRISPR2.1位點(diǎn)陽性率為88.69%，CRISPR2.2位點(diǎn)陽性率為88.70%，CRISPR2.3位點(diǎn)陽性率為7.42

5、%，CRISPR3位點(diǎn)陽性率5.65%，CRISPR4位點(diǎn)陽性率為5.65%，CRISPR3-4位點(diǎn)陽性率為93.28%。IS可插入到CRISPR/Cas系統(tǒng)周圍，也可插入到Cas基因中，甚至于插入到重復(fù)序列之間。
　　2.基于CRISPR的大腸桿菌分子分型方法的建立：根據(jù)CCT分型方法可獲得430個(gè)型別，根據(jù)CLPST分型方法可獲得215個(gè)型別，CCT、CLPST、MLST及Serotype四種分型方法的辛普森指數(shù)分別為0.88

6、64，0.8760，0.8581，0.8643。
　　3.間隔序列組成及排布方式與血清分型及 stx噬菌體的關(guān)系：stx噬菌體可在各CRISPR亞型中出現(xiàn)，并未發(fā)現(xiàn)菌株間隔序列排布方式與分離來源、分離時(shí)間及分離地區(qū)有關(guān)。
　　4.CRISPR分型方法在預(yù)測(cè)大腸桿菌血清型中的應(yīng)用：CRISPR分型方法預(yù)測(cè)O157:H7或NM、O104:H4、O16:H48、O5:H9、O111:H8或NM、O121:H19、O103:H2及