楊桃根中2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-環(huán)己二酮保護(hù)棕櫚酸誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞功能障礙的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討楊桃根中2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-環(huán)己二酮(DMDD)抗棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞功能障礙的作用，以及對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用。
　　方法:MIN6細(xì)胞分為6組:正常對(duì)照組(NC組)、模型組(PA組)、陽(yáng)性藥組（TAK-242組）、DMDD低、中、高劑量組(DMDDL、 DMDDM、和DMDDH組)。
　　1、DMDD對(duì)MIN6細(xì)胞胰島素水平、炎癥因子水平、凋亡

2、的影響:(1)DMDD對(duì)MIN6細(xì)胞胰島素水平的影響:采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA法）檢測(cè)細(xì)胞胰島素水平。(2) DMDD對(duì)MIN6細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響:ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)含量水平;實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA的表達(dá);(3) DMDD對(duì)MIN6細(xì)胞凋亡的影響:Annexin-

3、Ⅴ-FITC/Pl凋亡試劑盒、Hoechst33342/PI熒光雙染試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平;透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài);實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Caspase-3、Bax、Bcl-2 nRNA的表達(dá);western blot法檢測(cè)Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　2、DMDD對(duì)MIN6細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的影響:實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB p65 mR

4、NA的表達(dá);western blot法檢測(cè)TLR4、MyD88、細(xì)胞核磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、細(xì)胞漿磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、DMDD對(duì)MIN6細(xì)胞胰島素水平、炎癥因子水平、凋亡的影響:(1)DMDD對(duì)MIN6細(xì)胞胰島素水平的影響:與PA組相比，DMDDM組、DMDDH組、TAK-242組中分泌至細(xì)胞外的胰島素含量、細(xì)胞內(nèi)的胰島素含量及細(xì)胞內(nèi)外總胰島素含量水平

5、均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)，且呈劑量依賴關(guān)系。(2) DMDD對(duì)MIN6細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響:與PA組相比，DMDDL組、DMDDM組、DMDDH組、TAK-242組中IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA和含量水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01或p＜0.001)，且呈劑量依賴關(guān)系。(3) DMDD對(duì)MIN6細(xì)胞凋亡的影響:Annexin-V-FITC/P1凋亡試劑盒、Hoe

6、chst33342/PI熒光雙染試劑盒檢測(cè)結(jié)果均表明，與PA組相比，DMDDL組、DMDDM組、DMDDH組、TAK-242組中MIN6細(xì)胞總凋亡率均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01或p＜0.001)，且呈劑量依賴關(guān)系。透射電子顯微鏡觀察MIN6細(xì)胞凋亡形態(tài)結(jié)果表明，與PA組相比，DMDDL組、DMDDM組、DMDDH組、TAK-242組可以改善PA所致的MIN6細(xì)胞凋亡形態(tài)，且呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和

7、western blot結(jié)果表明，與PA組相比，DMDDM組、DMDDH組、TAK-242組Caspase-3、Bax mRNA水平均降低，Bcl-2 mRNA和蛋白水平均升高，Bcl-2/Bax升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01或p＜0.001)，且呈劑量依賴關(guān)系。與PA組相比，DMDDH組、TAK-242組Caspase-3、Bax蛋白水平均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)，且呈劑量依賴關(guān)

8、系。
　　2、DMDD對(duì)MIN6細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的影響:與PA組相比，LPS+PA組中TLR4 mRNA和蛋白、MyD88 mRNA和蛋白、NF-κBp65 mRNA和細(xì)胞核p-NF-κB p65蛋白、細(xì)胞漿p-IκBα蛋白水平均上調(diào)，DMDDH+PA組、TAK-242+PA組中TILR4 mRNA和蛋白、MyD88 mRNA和蛋白、NF-κB p65 mRNA和細(xì)胞核p-NF-κB p65蛋白、細(xì)胞漿

9、p-IκBα蛋白水平均下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。與LPS+PA組相比，LPS+DMDDH+PA組中TLR4 mRNA和蛋白、MyD88 mRNA和蛋白、NF-κBp65 mRNA和細(xì)胞核p-NF-κB p65蛋白、細(xì)胞漿p-IκBα蛋白水平均下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。與TAK-242+PA組相比，TAK-242+DMDDH+PA組中TLR4 mRNA和蛋白、MyD88 mRNA和蛋白、NF-κB p6