SSAT通過AKT-GSK-3β-β-catenin信號通路抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲.pdf

1、背景：結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤疾病，有著較高的發(fā)病率和死亡率，其排名僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌。研究結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制是抗癌治療過程中的一項長期任務。在癌癥的治療研究中，人們發(fā)現(xiàn)在癌癥患者體內(nèi)一類陽離子小分子化合物－多胺的代謝功能發(fā)生紊亂，因此多胺成為治療性干預中具有強吸引力的靶標。精脒/精胺-N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Spermidine/Spermine-N1-acetylransferase, SSAT）是多

2、胺代謝途徑的第一個限速酶，嚴格調(diào)控著細胞內(nèi)的多胺水平，因而成為了多胺與腫瘤關(guān)系研究中的一個熱點。然而，SSAT對結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其分子機制仍不完全清楚。
　　目的：以結(jié)直腸癌細胞（HCT116、HT-29）為研究對象，主要研究SSAT對結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其分子機制。
　　方法：首先用蛋白印跡檢測法（Western blot）實驗方法檢測結(jié)直腸癌細胞HCT116和HT-29中 SSAT蛋白

3、的表達情況。然后采用細胞轉(zhuǎn)染的方法使細胞內(nèi) SSAT的蛋白水平上調(diào)或者下調(diào)。采用高效液相色譜分析法（HighPertormance Liquid Chromatography, HPLC）檢測細胞內(nèi)的多胺水平。接著，通過克隆形成實驗和細胞生長曲線分析檢測了SSAT蛋白功能的獲得或者缺失后對細胞增殖能力的影響。另外，傷口愈合實驗以及不鋪膠的 Transwell小室實驗檢測了 SSAT改變對細胞的遷移能力的影響。鋪有基質(zhì)膠的Transwel

4、l小室實驗檢測了結(jié)直腸癌細胞的侵襲能力。利用Western blot檢測細胞內(nèi)AKT、p-AKT、p-GSK-3β、cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin和β-catenin等蛋白的表達。接著，加入外源性多胺后再次檢測細胞內(nèi)多胺的變化，并用Western blot檢測外源性多胺多胺是否影響 AKT/GSK-3β通路蛋白的變化。除此之外，Transwell小室實驗檢測了加入GSK-3β抑制劑 LiCl后結(jié)直腸癌細胞

5、的侵襲能力變化。并用 Western blot檢測了GSK-3β抑制受抑制后β-catenin蛋白的變化。
　　結(jié)果：⑴Western blot結(jié)果表明SSAT蛋白在結(jié)直腸癌細胞HCT116中的表達水平低于HT-29細胞。高效液相色譜分析法檢測結(jié)果表明通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)使 SSAT高表達的 HCT116細胞多胺水平降低，而轉(zhuǎn)染siRNA使SSAT低表達的HT29細胞內(nèi)多胺的水平上升。⑵克隆形成實驗和細胞生長曲線分析結(jié)果均表明過表達的

6、SSAT降低了細胞增殖能力，而低表達的 SSAT可促進細胞增殖。⑶傷口愈合實驗顯示過表達 SSAT細胞表現(xiàn)出遷移抑制作用，而低表達的 SSAT則促進了細胞的傷口愈合能力。同樣地，Transwell小室實驗檢測了細胞的垂直遷移能力，并得到了一致的結(jié)果。鋪基質(zhì)膠的 Transwell小室實驗檢測了細胞的侵襲能力，表明高表達的 SSAT抑制了細胞的侵襲能力，相反地，低表達的 SSAT細胞則增強了侵襲的能力。⑷Western blot實驗表明過

7、表達SSAT的結(jié)直腸癌細胞中AKT、p-AKT、p-GSK-3β、cyclin D1、和β-catenin蛋白表達下調(diào)，E-cadherin、N-cadherin蛋白水平上調(diào)。而低表達的SSAT結(jié)直腸癌細胞中蛋白水平變化與之相反。⑸外源性多胺的加入使過表達SSAT細胞內(nèi)多胺含量再次升高。Western blot檢測結(jié)果表明AKT、p-GSK-3β等蛋白水平出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。⑹GSK-3β抑制劑，LiCl的使用改變了SSAT對HCT116細胞的侵