畢赤酵母工程菌pk53產(chǎn)纖溶酶發(fā)酵的優(yōu)化研究.pdf

1、人體內的血栓常引發(fā)嚴重的心血管疾病,發(fā)病突然,死亡率極高,溶栓治療是搶救與治療此類疾病的常用手段。纖溶酶則能分解血栓的主要骨架纖維蛋白從而溶解血栓,以恢復血流通暢、促進組織恢復。該酶在發(fā)揮溶栓作用時,不水解血漿纖維蛋白質,故不易引起出血傾向。因此纖溶酶具有廣闊的研究開發(fā)前景。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)是目前最優(yōu)秀、應用最廣泛的外源基因表達系統(tǒng)之一。能使外源真核基因正確地翻譯和翻譯后加工,并能對許多蛋白質產(chǎn)物

2、進行分泌,使產(chǎn)物易于提純。目前畢赤酵母工程菌搖瓶培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基價格昂貴,本試驗在前期已構建產(chǎn)纖溶酶的基因工程菌菌株基礎上,對產(chǎn)纖溶酶畢赤酵母基因工程菌的培養(yǎng)基進行探索研究,找到了一種廉價的培養(yǎng)基配方,降低了纖溶酶的生產(chǎn)成本,并對其液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化及10L發(fā)酵罐的放大試驗。
　　 本文在搖瓶發(fā)酵水平上,對產(chǎn)纖溶酶畢赤酵母工程菌菌株pk53研究了不同碳源、氮源、磷酸鹽、金屬離子、表面活性劑等因素對畢赤酵母工程菌菌株pk53產(chǎn)

3、酶的影響,發(fā)現(xiàn)麩皮、豆粕粉、磷酸二氫鉀濃度對產(chǎn)酶的影響較大。對麩皮、豆粕粉、磷酸二氫鉀三因素各選取三個水平進行正交試驗,利用單因素試驗和正交試驗確定確定了其最佳培養(yǎng)基成分。確定該菌株的適宜廉價發(fā)酵培養(yǎng)基為:麩皮1.5％,豆粕粉2.0％,KH2PO40.5％,MgSO4·7H2O0.05％；分別考察了接種量、甲醇添加量、起始pH值、誘導pH值、裝液量等發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)酶的影響,確定其最佳培養(yǎng)條件為:接種齡14 h,接種量1％,甲醇添加量1

4、.5％,培養(yǎng)基裝液量30 mL(250mL三角瓶),生長pH為5.5,誘導pH為6.0；設計正交試驗來綜合考慮甲醇添加量、誘導pH、培養(yǎng)基起始PH、裝液量四個因素對產(chǎn)酶的影響。結果發(fā)現(xiàn)極差值R裝液量>R甲醇添加量>R誘導pH>R初始pH,根據(jù)單因素及正交試驗結果,確定發(fā)酵條件優(yōu)化配比為:裝液量30 mL、甲醇添加量1.5％、誘導pH6、初始pH5.5。在此條件下培養(yǎng),最大酶活為1841.28 U／ml,是出發(fā)菌株酶活力的3.02倍,且產(chǎn)